文 祎,王 振,蔡淑嫻,劉仲華,*

(1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410128; 2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南長(zhǎng)沙 410128; 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙410128)

近年來(lái)的研究表明,慢性、免疫病理性炎癥對(duì)人體的傷害非常大,與很多疾病相關(guān)。日常飲食習(xí)慣、吸煙、肥胖、病毒感染等因素都可能會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性低烈度系統(tǒng)炎癥,這些炎癥與心血管疾病、消耗性疾病、Ⅱ型糖尿病及腫瘤等疾病的發(fā)病危險(xiǎn)率的顯著升高密切相關(guān),也是炎癥性疾病如關(guān)節(jié)炎、哮喘等過(guò)敏癥的病因。因此,致力于有效抑制病理性的炎癥過(guò)程顯得尤為重要。

鐵觀音品種是烏龍茶中的主要優(yōu)良品種,素有“綠葉紅鑲邊,七泡有余香”的美稱(chēng)[1]。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展,飲用和品嘗茶的消費(fèi)者日漸增多,人們對(duì)茶的要求已逐漸從“溫飽型”轉(zhuǎn)向“美食型”和“保健型”。近年來(lái),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),茶多酚對(duì)治療心血管炎癥有很好的療效,此外,茶多酚對(duì)骨關(guān)節(jié)炎、腸道炎、腎炎等[2]也具有顯著療效,其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)生物活性最強(qiáng),抗炎效果最佳。鐵觀音中富含茶多酚、茶氨酸、咖啡堿等多種活性成分,使得茶葉具備多種有效的保健功能[3-4],如降血脂、降血糖、防輻射、抗腫瘤等[5-7],其潛在功效機(jī)制除與抗氧化作用有關(guān)外,還與其抗炎作用密切相關(guān)[4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于茶葉活性成分單體抗炎作用的研究頗多,可對(duì)于茶葉水提物的抗炎功能研究甚少。

為了更全面地了解安溪鐵觀音的抗炎保健功能,本實(shí)驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型[8],并用吲哚美辛和不同濃度鐵觀音提取物處理,檢測(cè)NO和IL-6的分泌情況,qPCR檢測(cè)一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶2(COX-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)mRNA相對(duì)表達(dá),Western Blot檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白激酶(IKKβ),核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子(IκB)、核轉(zhuǎn)錄因子κBp65(NFκB p65)及其磷酸化產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá),探究鐵觀音的體外抗炎活性及機(jī)制,為其防治炎癥疾病、開(kāi)發(fā)抗炎藥物提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心;安溪鐵觀音 八馬茶業(yè)股份有限公司;N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈 國(guó)產(chǎn)分析純;兒茶素、沒(méi)食子酸、可可堿、茶堿標(biāo)準(zhǔn)品、LPS和吲哚美辛 Sigma公司;噻唑藍(lán)(MTT)、qPCR引物 上海生工生物公司;DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司;胎牛血清 BI公司;SYBR premix EX Taq試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本TakaRa公司;IKKβ、IκB、p65、p-IKKβ、p-IκB、p-p65蛋白抗體 CST公司;NO檢測(cè)試劑盒 碧云天試劑公司;總RNA提取試劑盒 全式金生物公司;IL-6ELISA試劑盒 博士德生物公司;HRP標(biāo)記的二抗 Abcam公司;增強(qiáng)型ECL發(fā)光液 Engreen公司。

EL-131型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀 Buchi公司;GAMMA1-20真空冷凍干燥機(jī) CHRIST公司;紫外分光光度計(jì)、LC-2010AHT高效液相色譜儀 Shimadzu公司;opticlean-1300超凈工作臺(tái) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;CO2培養(yǎng)箱 Nuaire公司;倒置顯微鏡 Leica公司;Rotor-Gene Q熒光定量PCR儀、Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司;Rotina380普通離心機(jī) Hettich公司;精密電子天平 Starorius公司;FluorChem FC2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 南京非同科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵觀音茶提取物的制備 稱(chēng)取鐵觀音茶樣50 g,加入500 mL沸水水浴加熱45 min,過(guò)濾后再加入250 mL沸水,水浴30 min,合并濾液經(jīng)冷凍干燥30 h制成茶粉,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鐵觀音茶提取物主要成分的測(cè)定 茶多酚的測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8313-2008;游離氨基酸的測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8314-2013;兒茶素組分、生物堿和沒(méi)食子酸含量的測(cè)定采用HPLC檢測(cè)法[9]。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 處理RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)傳代,培養(yǎng)箱設(shè)置條件為37 ℃、5% CO2。將RAW264.7細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿上,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組處理,正常對(duì)照組:不做任何處理,正常培養(yǎng)24 h;炎癥模型組:1 μg/mL脂多糖(LPS)持續(xù)刺激細(xì)胞24 h;陽(yáng)性對(duì)照組:1 μg/mL LPS和20 μg/mL吲哚美辛[10]共同處理細(xì)胞24 h;鐵觀音茶提取物處理組:1 μg/mL LPS和不同濃度鐵觀音茶提取物(50、100、200 μg/mL)共同處理細(xì)胞24 h。

1.2.4 鐵觀音茶提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 RAW264.7細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔板,按上述分組給藥,24 h后吸除上清液,每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h;再次吸除上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔于搖床上輕晃10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值(A490 nm)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力:細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(處理組的吸光度/對(duì)照組吸光度)×100。

1.2.5 iNOS、COX2、TNF-α、MCP-1和IL-6基因表達(dá)的測(cè)定 提取各組細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,熒光定量qPCR檢測(cè)炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α、MCP-1、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá),引物利用primer軟件設(shè)計(jì),并由上海生工生物技術(shù)公司合成,具體引物信息見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)參及目的基因熒光定量PCR反應(yīng)的引物序列Table 1 Primer sequences of reference and target genes in qPCR reaction

熒光定量qPCR選用TaKaRa的SYBR premix EX Taq試劑盒,設(shè)置反應(yīng)條件如下:95 ℃變性 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,重復(fù)反應(yīng)40個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s。每個(gè)標(biāo)本均作三個(gè)復(fù)孔,復(fù)孔間的Ct值差異控制在0.5以?xún)?nèi),選用2ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平。

1.2.6 NO的分泌和IL-6的表達(dá)情況RAW264.7細(xì)胞系以1.5×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板,按照上述分組處理細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞上清液200 μL/孔,按NO試劑盒和IL-6ELISA試劑盒說(shuō)明操作,測(cè)定細(xì)胞上清液中NO和IL-6含量。

1.2.7 Western blot蛋白免疫印記分析 按上述分組處理細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞并RIPA裂解提取總蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度并制成待測(cè)樣品。用4.8%～10% SDS-PAGE膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉60 min,隨后加入一抗(1∶1000)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌三次后加二抗(1∶10000)于室溫孵育1 h,再次充分洗滌后,加入200 μL ECL化學(xué)發(fā)光液,FluorChem FC2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵觀音茶提取物中主要活性成分及組分含量

由表2可知,鐵觀音茶提取物中,茶多酚含量最高,達(dá)總量的59.27%,其次是游離氨基酸、生物堿。沒(méi)食子酸和兒茶素是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的主要構(gòu)成,鐵觀音茶提取物中沒(méi)食子酸含量為0.58%,兒茶素組分含量有一定的差異,表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)單體含量最高,其中EGCG達(dá)18.19%?？Х葔A是生物堿的主要組成部分,占水提物總量的9.79%,占生物堿總量的98.8%以上,茶葉水提物中幾乎不含茶葉堿,可可堿含量甚微,主要原因可能是水提過(guò)程中咖啡堿極易浸出。

表2 鐵觀音茶提取物中主要活性成分及組分含量Table 2 Content of main active ingredients and components in Tieguanyin tea extract

2.2 鐵觀音茶提取物對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,鐵觀音茶提取物在50、100和200 μg/mL三個(gè)濃度劑量下,單獨(dú)作用或與LPS共同作用處理24 h后對(duì)RAW264.7細(xì)胞的相對(duì)活力均無(wú)明顯影響,表明在濃度范圍內(nèi),鐵觀音茶提取物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用(圖1)。

圖1 不同濃度鐵觀音茶提取物 對(duì)RAW264.7細(xì)胞相對(duì)活力的影響Fig.1 Effect of Tieguanyin tea extracts on thecell viability of RAW264.7 cells

2.3 鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子的影響

LPS作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種特有成分,能誘發(fā)細(xì)胞的炎癥反應(yīng),在體外實(shí)驗(yàn)中多采用LPS誘導(dǎo)RAW64.7細(xì)胞作為炎癥模型評(píng)價(jià)藥物的抗炎活性[11]。誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)是兩個(gè)重要的炎癥相關(guān)蛋白,在正常狀態(tài)下幾乎不表達(dá),當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí),細(xì)胞被活化,誘導(dǎo)iNOS和COX-2基因和蛋白表達(dá),加劇炎性損傷[12]。如圖2所示,與正常對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞中iNOS和COX-2 mRNA水平極顯著升高(p<0.01);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組和鐵觀音組均可明顯降低iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)水平,對(duì)COX-2的表達(dá)影響呈劑量依賴(lài)性,然而鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)iNOS轉(zhuǎn)錄水平升高的抑制作用極顯著地弱于吲哚美辛(p<0.01)。

圖2 鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中 iNOS和COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Tieguanyin tea extracts on the mRNA expressions of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells after LPS stimulation注:模型組與對(duì)照組相比,##p<0.01;藥物處理組 與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在LPS的誘導(dǎo)下激活,合成并釋放出的大量炎癥介質(zhì),產(chǎn)生的炎性相關(guān)因子如TNF-α、MCP-1、IL-6等相互促進(jìn),使得炎癥反應(yīng)進(jìn)程加劇。如圖3所示,與正常對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞中TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA水平極顯著升高(p<0.01);陽(yáng)性藥物和50、100、200 μg/mL鐵觀音均可降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA表達(dá)水平升高,且鐵觀音茶提取物的作用效果呈劑量依賴(lài)性,鐵觀音高劑量組對(duì)IL-6和MCP-1mRNA水轉(zhuǎn)錄抑制作用優(yōu)于吲哚美辛。本研究表明,鐵觀音茶取提物能夠下調(diào)TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子mRNA的表達(dá),表明鐵觀音茶提取物能在基因水平抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子的表達(dá),具有很好的體外抗炎活性。

圖3 鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、 IL-6、MCP-1mRNA相對(duì)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Tieguanyin tea extracts on the mRNA expressions of TNF-α,IL-6 and MCP-1 in RAW264.7 cells after LPS stimulation

2.4 鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后NO和IL-6分泌表達(dá)的影響

NO是一種重要的炎癥介導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子,參與多種機(jī)體內(nèi)的生理過(guò)程,如果長(zhǎng)期處于高濃度狀態(tài)會(huì)引發(fā)機(jī)體許多疾病;小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在LPS的誘導(dǎo)下釋放出的大量的促炎因子IL-6,IL-6的累積會(huì)使得炎癥反應(yīng)進(jìn)程加劇。如圖4所示,模型組細(xì)胞NO和IL-6的分泌均極顯著高于正常組(p<0.01);與模型組相比,三個(gè)濃度的鐵觀音茶提取物均顯著地抑制了RAW264.7細(xì)胞中NO和IL-6的分泌(p<0.05),且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性,推測(cè)這可能與鐵觀音茶提取物能抑制環(huán)氧化酶信號(hào)途徑的活化有關(guān)。

圖4 鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO分泌及IL-6蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Tieguanyin tea extracts on the secretions of NO and IL-6 in RAW264.7 cells after LPS stimulation

2.5 鐵觀音茶提取物對(duì)NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響

如圖5(A)所示,經(jīng)LPS(1 μg/mL)處理48 h后,細(xì)胞中IKKβ、IκB總蛋白無(wú)明顯變化,而p-IKKβ和p-IκB相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(p<0.01),吲哚美辛和高濃度的鐵觀音茶提取物干預(yù)后,磷酸化產(chǎn)物p-IKKβ和p-IκB均極顯著降低(p<0.01),說(shuō)明鐵觀音茶提取物能抑制NF-κB信號(hào)通路的激活,為了驗(yàn)證這一點(diǎn),繼續(xù)檢測(cè)p65和p-p65的蛋白表達(dá),結(jié)果表明,高濃度鐵觀音茶提取物也能極顯著抑制p65發(fā)生磷酸化作用(p<0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與茶葉活性成分抗炎的文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13-14],且高濃度鐵觀音茶提取物的抗炎活性強(qiáng)于20 μg/mL的陽(yáng)性藥吲哚美辛。

圖5 鐵觀音茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后磷酸化IKKβ、IκB、p65相對(duì)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Tieguanyin tea extracts on the phosphorylation of IKKβ,IκB and p65 in RAW264.7 cells after LPS stimulation

3 討論與結(jié)論

NO和IL-6是參與炎癥反應(yīng)的兩個(gè)重要炎性介質(zhì),炎癥發(fā)生時(shí)釋放大量的NO和IL-6。NO的表達(dá)是通過(guò)其上游關(guān)鍵酶iNOS來(lái)控制的。本研究表明鐵觀音茶提取物能顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO和IL-6的釋放(p<0.05),并進(jìn)一步檢測(cè)了鐵觀音茶提取物對(duì)NO的上游關(guān)鍵酶iNOS mRNA表達(dá)及促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明,鐵觀音茶提取物對(duì)NO和IL-6等炎癥因子的表達(dá)抑制是通過(guò)下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白iNOS和COX-2的基因表達(dá)和促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,且高濃度時(shí)抑制效果極顯著(p<0.01)。

NF-κB信號(hào)通路是LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子下游的一條重要通路,與促炎性酶如iNOS和COX-2等的表達(dá)及炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1等的合成分泌密切相關(guān)。如圖6所示,NF-κB是基因調(diào)控的炎癥疾病中重要的核轉(zhuǎn)錄因子,蛋白家族包括p65、p50等,當(dāng)NF-κB與NF-κB抑制蛋白IκB結(jié)合在一起時(shí),細(xì)胞處于靜息狀態(tài)存在,細(xì)胞受到外界信號(hào)LPS刺激時(shí),IκB發(fā)生磷酸化或泛素化被IκB激酶IKK降解,NF-κB核定位序列暴露,隨之游離出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞核,并與其靶基因上游調(diào)控序列相結(jié)合,啟動(dòng)包括iNOS、IL-6、TNF-α、MCP-1、COX-2等炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

圖6 鐵觀音茶提取物對(duì)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用Fig.6 Regulation of Tieguanyin tea extracts on NF-κB signaling pathways注:鐵觀音茶提取物┤指鐵觀音茶提取物具下調(diào)或抑制作用。 鐵觀音茶提取物可有效抑制IKK、IκB和NF-κB p65 磷酸化來(lái)阻斷NF-κB的激活,使其發(fā)揮顯著的抗炎功效。

鐵觀音茶提取物含有大量的茶多酚、氨基酸和生物堿,而這些活性成分在很多體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,已被證實(shí)可通過(guò)抑制NF-κB通路的激活而表現(xiàn)出來(lái)一定程度的抗炎功效[8,15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鐵觀音茶提取物也是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用,即抑制上游蛋白IKKβ和IκB的磷酸化,減少NF-κB p65蛋白的激活,進(jìn)而減少NF-κB p65與靶基因結(jié)合后產(chǎn)生釋放各種炎癥因子,從而發(fā)揮顯著的抗炎作用,且高濃度鐵觀音茶提取物的抗炎活性強(qiáng)于20 μg/mL的陽(yáng)性藥吲哚美辛。

本論文只是單一的從體外方面研究了鐵觀音茶提取物的抗炎作用和機(jī)制,仍需有進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,且在分子作用機(jī)制的研究中未檢測(cè)NF-κB p50等蛋白的表達(dá)和NF-κB核轉(zhuǎn)位情況,因此還需進(jìn)一步加深研究以便充分開(kāi)發(fā)鐵觀音茶提取物的抗炎活性。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)探討鐵觀音茶的抗炎作用,并初步闡明了其抗炎作用機(jī)制,這對(duì)今后炎癥相關(guān)疾病的研究、防治及開(kāi)發(fā)具有抗炎作用的藥物等具有參考意義。