孫墨可，李曉薇，孫曉文，張 曼，田 娟，董玉迪，李海燕*

(1.吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)實驗室，吉林白城 137000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林長春 130118；3.吉林省鎮(zhèn)賚縣蘆葦濕地管理站，吉林鎮(zhèn)賚 137300)

靈芝是我國的傳統(tǒng)藥用真菌，在我國和東南亞國家有著悠久的應(yīng)用歷史[1]。靈芝含有多糖、萜類化合物、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等多種活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及延緩衰老的作用[2-7]。自Mishra等[8]首次實現(xiàn)粗糙鏈孢霉(Neurosporecrassa)的 DNA 轉(zhuǎn)化以來，已經(jīng)成功建立了許多絲狀真菌外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系。近年來，研究人員對靈芝轉(zhuǎn)化方法進行了廣泛和深入的研究。Sun等[9]將電擊轉(zhuǎn)化方法引入靈芝的分子遺傳學(xué)研究中，獲得15個轉(zhuǎn)化子。Kim等[10]在靈芝中成功應(yīng)用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，獲得4～17個轉(zhuǎn)化子。郭溆等[11]從靈芝中克隆了合成三萜的關(guān)鍵元件GLCYP450 及其還原酶 GLNADPH的基因，并在酵母中獲得了表達；方星等[12]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將靈芝甾醇14α-脫甲基酶基因在靈芝中進行表達。逄春梅等[13]通過電擊法將雙元細菌人工染色體(BIBAC)載體上的100 kb人參大片段DNA轉(zhuǎn)化到靈芝原生質(zhì)體內(nèi)。筆者利用PEG轉(zhuǎn)化法將帶有GPD啟動子及GFP綠色熒光蛋白的表達載體pCAMBIA1302轉(zhuǎn)入靈芝原生質(zhì)體中，以期為利用靈芝作為生物反應(yīng)器表達蛋白及其中間產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料靈芝(Goanodermalucidum)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所保存。大腸桿菌 DH5a 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器保存。質(zhì)粒pCAMBIA1302及TaqDNA聚合酶購自大連TaKaRa公司。

1.2菌株培養(yǎng)將靈芝菌絲接入PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為搖床120 r/min，28 ℃培養(yǎng)6 d。將大腸桿菌DH5a在LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，在含有15%甘油的LB培養(yǎng)基中，-80 ℃保存。

1.3引物序列PCR 引物均由金唯智公司合成，GPD啟動子引物為GPD - F：5′- GCTCTAGACGTTCGTGACTCGCAATATC-3′；GPD- R：5′- CGGGATCCTGCGGGTGAAAGAGGAGG-3′。

檢測靈芝轉(zhuǎn)化子GFP引物為GFP -F：5′- GTTGTATAATAGCACCCGGTTT -3′；GFP-R：5′- GGCTCGGTACGGAAGTTG -3′。

1.4平菇基因組DNA的提取將平菇菌種接種于液體PDA培養(yǎng)基中，27 ℃培養(yǎng)6 d后，收集菌絲，采用TPS法提取平菇基因組。

1.5構(gòu)建pCAMBIA1302重組表達載體

1.5.1PCR 擴增 GPD啟動子。根據(jù)已報道的平菇GPD啟動子序列設(shè)計2對引物，由金唯智公司合成，以平菇基因組 DNA為模板進行GPD啟動子片段的擴增。擴增程序為預(yù)變性94 ℃7 min；變性94 ℃45 s，退火65 ℃45 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；延伸72 ℃ 7 min反應(yīng)終止，于4 ℃保存。取2 μL擴增PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂電泳，檢測PCR擴增結(jié)果。電泳結(jié)果后連接T載體測序。

1.5.2雙酶切。將pCAMBIA1302質(zhì)粒用NcoI 和BamH I于37 ℃進行過夜酶切，切膠回收大片段，用NcoI和BamH I限制性內(nèi)切酶處理pSB1302質(zhì)粒。 酶切后置于65 ℃水浴鍋中反應(yīng)12 min使限制性內(nèi)切酶失活。

1.5.3GPD啟動子連接pCAMBIA1302。用Solution Ⅰ 連接載體與基因，于4 ℃進行過夜連接，將連接產(chǎn)物加入到大腸桿菌感受態(tài)中進行轉(zhuǎn)化，過夜培養(yǎng)后，挑單菌落進行菌液PCR和酶切的驗證，鑒定結(jié)果為陽性則測序。

1.6靈芝原生質(zhì)體潮霉素抗性篩選對靈芝原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中的潮霉素抗性濃度進行篩選，分別選取濃度值為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 mg/mL的潮霉素放入固體MYG培養(yǎng)基中，將制備好的原生質(zhì)體均勻地平鋪到MYG培養(yǎng)基中，5～7 d后觀察原生質(zhì)體再生結(jié)果。

1.7PEG介導(dǎo)的靈芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體制備參照試驗前期得到的最優(yōu)靈芝原生質(zhì)體制備方法進行[14]。取1×106個靈芝原生質(zhì)體，放入MYG 液體培養(yǎng)基中，加入10～20 μg 待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，再加入 1 mL PEG 緩沖液(25% PEG4000，10 mmoL/L CaCl2，10 mmoL/L Tris-HCl，pH 7.4)，冰浴20 min。然后再加入1 mL PEG緩沖液，混勻后室溫放置5 min，4 000 r/min離心5 min 沉淀原生質(zhì)體，最后重新懸浮原生質(zhì)體于1 mL MYG再生培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)5 d，涂布含有40 mg/mL潮霉素的MYG再生平板。一般7～10 d后轉(zhuǎn)化子在抗性平板上長出。

1.8靈芝轉(zhuǎn)化子的鑒定

1.8.1PCR檢測靈芝轉(zhuǎn)化子。從帶有潮霉素抗性平板上挑取轉(zhuǎn)化子，利用CTAB法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA。以轉(zhuǎn)化子DNA為模板，利用引物GFP-F和GFP-R擴增GFP基因片段。擴增程序為預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性94 ℃45 s，退火52 ℃ 45 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；延伸72 ℃7 min反應(yīng)終止，于4 ℃保存。

1.8.2熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化的靈芝菌絲。在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化GFP綠色熒光蛋白的靈芝轉(zhuǎn)化子，觀察靈芝菌絲在倒置熒光顯微鏡下是否有熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1TPS法提取平菇基因組TPS 是提取水稻基因組的一種方法，它是一種小量的快速簡單提取真菌基因組的方法，首次運用到提取平菇基因組，可以看出 TPS 法提取平菇基因組電泳條帶清晰，證明基因組提取成功(圖 1)。

注：M.DL10000 Marker；1～5.平菇基因組Note：M.DL10000 Marker； 1-5.Pleurotus ostreatus genome圖1 平菇基因組Fig.1 Pleurotus ostreatus genome

2.2pCAMBIA1302表達載體構(gòu)建以 pCAMBIA1302為基礎(chǔ)表達載體，將其中的原啟動子 35s替換為GPD啟動子(圖2)。

圖2 表達載體 pCAMBIA1302 圖譜Fig.2 Construction of expression vector pCAMBIA1302

2.2.1GPD啟動子的克隆。根據(jù)已報道的GPD啟動子的序列設(shè)計引物GPD-F1和GPD-R1，并引入酶切位點NcoI和BamH I。經(jīng)過Kan抗性篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進行PCR、酶切鑒定并測序，得到正確的GPD啟動子(圖3)。

注：M.DL2000 Marker；1.GPD啟動子Note：M.DL2000 Marker；1.GPD promoter圖3 GPD 啟動子的 PCR 擴增檢測Fig.3 PCR amplification of GPD promoter

2.2.2pCAMBIA1302表達載體構(gòu)建。提取重組 pCAMBIA1302 菌液質(zhì)粒，分別經(jīng)NocI和BamH I雙酶切后進行電泳檢測并測序表明，GPD啟動子已經(jīng)成功構(gòu)建到pCAMBIA1302 表達載體中(圖4)。

注：M.DL2000 Marker； 1～6.GPD 啟動子Note：M.DL2000 Marker；1-6.GPD promoter圖4 質(zhì)粒 pCAMBIA1302上Nco I 和BamH I 雙酶切驗證Fig.4 The digestion verification of plasmid pCAMBIA1302 by Nco I and BamH I

2.2.3靈芝原生質(zhì)體潮霉素抗性篩選。對靈芝原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中的潮霉素抗性濃度進行篩選，結(jié)果表明靈芝原生質(zhì)體在MYG再生培養(yǎng)基中，潮霉素的最低抑制篩選濃度為45 mg/mL(圖5)。

2.3靈芝轉(zhuǎn)化子的檢測通過 PEG 轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體，并在帶有潮霉素抗性的平板上培養(yǎng)，潮霉素抗性試驗表明，潮霉素對靈芝原生質(zhì)體的最低抑制質(zhì)量濃度為45 mg/mL。將假定轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于含40 μg/mL 潮霉素篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選8 d，菌落能夠在抗性平板上繼續(xù)生長。隨機提取2個轉(zhuǎn)化子，用GFP片段進行PCR 檢測(圖6)。

圖5 靈芝原生質(zhì)體在帶有潮霉素抗性培養(yǎng)基中的生長情況Fig.5 The growth of protoplast of G.lucidum in culture medium with hygromycin resistance

注：M.DL2000 Marker；1～2.靈芝轉(zhuǎn)化子 Note：M.DL2000 Marker；1-2.G. lucidum transformants圖6 靈芝轉(zhuǎn)化子中GFP的PCR驗證Fig.6 PCR detection of GFP in G.lucidum transformants

2.4熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化的靈芝菌絲在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化后GFP綠色熒光蛋白的靈芝轉(zhuǎn)化子，可以看出部分靈芝菌絲在倒置熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光色，由此表明，GFP綠色熒光蛋白在靈芝菌絲中有表達(圖7)。

3 結(jié)論

利用TPS法提取平菇基因組，此方法簡單易行，適用于小量提取基因組。該研究建立了由PEG介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化體系，首先將GPD啟動子構(gòu)建到帶有GFP綠色熒光蛋白的pCAMBIA1302表達載體中，通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體，以及潮霉素的抗性篩選，獲得了一批具有潮霉素抗性的靈芝轉(zhuǎn)化子菌株，并通過PCR擴增GFP基因片段和熒光倒置顯微鏡試驗證實外源基因片段GFP已成功轉(zhuǎn)化進靈芝轉(zhuǎn)化子的基因組中。食用菌等大型絲狀真菌的轉(zhuǎn)化效率較低，遠遠低于絲細菌和酵母的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化效率高低也許與物種本身有關(guān)。該研究建立了靈芝轉(zhuǎn)化體系，使靈芝作為一種新的生物反應(yīng)器，為今后分子生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

注：A.靈芝轉(zhuǎn)化子；CK.未轉(zhuǎn)化的靈芝菌絲Note：A.G.lucidum transformants；CK.Untransformed G.lucidum mycelia圖7 在熒光倒置顯微鏡下觀察靈芝菌絲Fig.7 The mycelium of G. lucidum was observed under a fluorescence inverted microscope