李生茂 劉琳 潘媛 敖慧 唐友愛(ài)

【摘 要】 目的：研究川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分及其抗氧化活性。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析其化學(xué)成分，分別采用1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）法和2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）法評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果：川芎揮發(fā)油中共檢出73個(gè)色譜峰，確認(rèn)了其中33個(gè)色譜峰所代表的化學(xué)成分，占總峰面積的85.15%，其中以Z-藁本內(nèi)酯相對(duì)含量最高，占總峰面積的46.17%。川芎揮發(fā)油對(duì)DPPH和ABTS自由基均具有清除作用，IC50分別為0.2325 mg/mL和0.1763 mg/mL。結(jié)論：川芎揮發(fā)油主要含有以藁本內(nèi)酯為代表的內(nèi)酯類成分，具有一定抗氧化活性。研究結(jié)果可為川芎揮發(fā)油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

【關(guān)鍵詞】 川芎；揮發(fā)油；GC-MS；抗氧化

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）02-0016-05

Abstract：Objective To study chemical constituents and antioxidant capacity of the essential oil from Ligusticum chuanxiong Hort. Methods The essential oil of Ligusticum chuanxiong Hort was obtained by steam distillation and its chemical constituents was analyzed and identified by GC-MS. The antioxidant capacity of the essential oil was determined by DPPH and ABTS free radical scavenging method. Results 73 chemical compounds were detected and 33 compounds（representing 85.15% of the total peak area） were identified in the essential oil from Ligusticum chuanxiong Hort， and the major compound was Z-Ligustilide （representing 46.17% of the total peak area）. The essential oil from Ligusticum chuanxiong Hort had the effect of scavenging DPPH and ABTS free radical， and the IC50 was 0.2325mg/mLand 0.1763mg/mL respectively. Conclusion The main component of essential oil from Ligusticum chuanxiong Hort was Z-Ligustilide. The essential oil had antioxidant activity. This study will provide reference for further development of the essential oil from Ligusticum chuanxiong Hort.

Keywords：Ligusticum chuanxiong Hort； Essential oil； GC-MS； Antioxidant

川芎為傘形科藁本屬多年生草本植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中醫(yī)認(rèn)為其性溫，味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1-3]。現(xiàn)代研究顯示[4-11]，揮發(fā)油是川芎主要的活性物質(zhì)之一，其含有苯酞類、烯萜醇及脂肪酸類等類化學(xué)成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙、改善血液流變、降血壓、抗缺血再灌注損傷及抗氧化等多種藥理作用。其中，抗氧化是川芎揮發(fā)油重要的活性之一，與其體內(nèi)對(duì)抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血再灌注損傷的作用關(guān)系密切[11-12]，但目前有關(guān)川芎揮發(fā)油的研究，多集中在不同提取方法基礎(chǔ)上的化學(xué)成分比較，或單純的藥效評(píng)價(jià)，而關(guān)于其體外抗氧化活性的研究報(bào)道較少?；诖耍緦?shí)驗(yàn)在水蒸氣蒸餾法獲得川芎揮發(fā)油的基礎(chǔ)上，采用GC-MS分析其化學(xué)成分，并采用DPPH、ABTS法觀察其抗氧化活性，以期為川芎揮發(fā)油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 川芎藥材購(gòu)于成都五塊石中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)陳璐副教授鑒定為川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖。正己烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20100928）；無(wú)水硫酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140114）；1，1-二苯基苦基苯肼（sigma公司，批號(hào)：034K1071）， 蘆?。ㄋ拇ㄊ【S克奇生物科技有限公司，批號(hào)：130824）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（aladdin 公司，批號(hào)：L1619007）；過(guò)硫酸鉀（aladdin公司，批號(hào)：A1719017），甲醇（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：201309230），水為蒸餾水（自制）。

1.2 儀器 Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）；Agilent GC-MSD工作站（美國(guó)安捷倫公司）；Ohaus Discovery十萬(wàn)分之一電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；Epoch 微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)BIOTEK 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎揮發(fā)油的制備 取川芎藥材粉碎，過(guò)20目篩，稱取粗粉約200g，置2000mL圓底燒瓶中，加入1200mL蒸餾水，按《中國(guó)藥典》2015年版一部揮發(fā)油測(cè)定法進(jìn)行，水蒸汽蒸餾5h，得川芎揮發(fā)油約0.71mL。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 分析條件 GC條件：載氣為氦氣；體積流量1.0mL/min；程序升溫，初始溫度50℃，保持2min；10℃/min速率升至120℃，保持8min；5℃/min速率升至180℃，保持8min；20℃/min速率升至260℃，保持4min，分流進(jìn)樣，分流比：1∶[KG-*3/5]60；進(jìn)樣量1μL；進(jìn)樣口溫度280℃。

MS條件：EI電離；電子能量70 eV；離子源溫度220℃；全掃描方式。

2.2.2 樣品測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下制備樣品，加正己烷稀釋，用無(wú)水硫酸鈉除去水分，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定川芎揮發(fā)油的總離子流圖，并通過(guò)NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，確定各色譜峰代表的化學(xué)成分。川芎揮發(fā)油中共檢出73個(gè)色譜峰，鑒定了其中的33個(gè)色譜峰，其峰面積之和占總峰面積的85.15%，其中烷烴類成分占0.52%，烯烴類成分占9.62%，酚類成分占2.21%，醇類成分占5.33%，醛酮類成分占1.89%，酯類成分占65.04%（其中內(nèi)酯類成分為63.31%）。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 清除DPPH自由基 參照文獻(xiàn)方法[17-18]并略做修改，稱取適量DPPH加甲醇配制成濃度為170μmol/L的溶液，避光保存。取川芎揮發(fā)油樣品或蘆丁適量，加甲醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。取0.15 mL供試品溶液與0.15mL DPPH溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置60 min，517nm處測(cè)定吸收度A1；同時(shí)測(cè)定0.15 mL供試品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2，按公式計(jì)算清除率：DPPH自由基清除率=[1-（A1-A0）]/A2×100%。以清除率（Y）對(duì)藥物濃度（X）進(jìn)行回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度（IC50），川芎揮發(fā)油清除DPPH自由基的IC50為0.2325mg/mL。同法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照蘆丁的IC50值為3.8888μg/mL，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖3。

2.3.2 清除ABTS自由基 參照文獻(xiàn)方法[17-18]并略做修改， 將10 mL 2 mM ABTS水溶液與100 μL 70 mM過(guò)硫酸鉀溶液混合，室溫避光放置12h，得ABTS儲(chǔ)備液。使用前用甲醇稀釋成工作液，使在734nm波長(zhǎng)下的吸光度為（0.70±0.05）。取川芎揮發(fā)油樣品適量，加甲醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。測(cè)定時(shí)，取0.045mL供試品溶液+0.155mL ABTS溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置20min，734nm處測(cè)定吸收度A1；同時(shí)測(cè)定0.045mL供試品+0.155mL甲醇的吸收度A0和0.045mL甲醇+0.155mL ABTS溶液的吸收度A2，按公式計(jì)算清除率：ABTS自由基清除率=[1-（A1-A0）]/A2×100%。以清除率（Y）對(duì)藥物濃度（X）進(jìn)行回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度（IC50），川芎揮發(fā)油清除ABTS自由基的IC50為0.1763mg/mL，同法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照蘆丁的IC50 值為5.1618μg/mL，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖3。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，并采用GC-MS對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，共檢測(cè)出73個(gè)色譜峰，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索鑒定了其中33個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，所鑒定的化合物色譜峰峰面積之和占總峰面積的85.15%，可以較好地代表川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分特征。而從已鑒定的化合物結(jié)構(gòu)類型來(lái)看，川芎揮發(fā)油中含量最高的是以Z-藁本內(nèi)酯（46.17%）為代表的酯類化學(xué)成分，占總峰面積的65.04%（其中內(nèi)酯類成分為63.31%），其它類成分含量高低依次為烯烴類、醇類、酚類、醛酮類和烷烴類化學(xué)成分。

DPPH自由基法、ABTS自由基法是目前常用的研究藥物對(duì)自由基清除作用的方法之一[19-20]。筆者結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，在前期研究基礎(chǔ)上，采用基于96孔板結(jié)合酶標(biāo)儀檢測(cè)的方法對(duì)川芎揮發(fā)油清除DPPH自由基、ABTS自由基的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，與常用的基于紫外分光光度計(jì)測(cè)定的清除自由基活性方法比較[11]，具有操作簡(jiǎn)便，節(jié)省試劑和樣品，并可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果顯示，川芎揮發(fā)油在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，均具有不同程度的清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，并具有較好的量效依賴關(guān)系，但其對(duì)兩種自由基的清除活性均小于陽(yáng)性對(duì)照蘆丁。

實(shí)驗(yàn)在采用GC-MS分析川芎揮發(fā)油化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，僅觀察了其體外清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，而川芎揮發(fā)油對(duì)其它自由基有無(wú)清除作用及其抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為川芎揮發(fā)油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

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