黃益領(lǐng) 陳 湧

浙江省平陽(yáng)縣人民醫(yī)院普外科1(325400) 岳陽(yáng)市二人民醫(yī)院普外科2

背景：蛇孢菌素A(OphA)是一種由雙極霉屬真菌產(chǎn)生的二倍半萜化合物，已被證實(shí)在多種實(shí)體瘤中具有抗癌效應(yīng)，但其在直腸癌中的作用尚不明確。目的：研究OphA對(duì)人直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其可能作用機(jī)制。方法：體外人直腸癌細(xì)胞株SW480經(jīng)OphA和(或)活性氧簇(ROS)清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)作用后，以光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和ROS表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)和NF-κB活化情況。結(jié)果：OphA可劑量依賴性地抑制體外SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，細(xì)胞色素C、cleaved caspase-3、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)表達(dá)上調(diào)，Bcl-2、p-NF-κBp65表達(dá)下調(diào)。以NAC清除ROS可明顯阻斷OphA對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，同時(shí)逆轉(zhuǎn)上述相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)論：OphA可能通過(guò)ROS介導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡，抑制人直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。NF-κB信號(hào)通路可能參與了ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

蛇孢菌素(ophiobolin, Oph)是一類具有三環(huán)或四環(huán)結(jié)構(gòu)的二倍半萜類化合物，主要由侵染農(nóng)作物的雙極霉屬真菌產(chǎn)生，具有抑制植物胚芽鞘、根系生長(zhǎng)和種子萌發(fā)等植物毒性作用，其作用機(jī)制與破壞細(xì)胞膜通透性、減少光合作用和抑制核酸合成有關(guān)[1-2]。隨著越來(lái)越多的Oph被分離和鑒定，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Oph除對(duì)細(xì)菌和線蟲具有殺滅作用外，還能有效抑制HIV和多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，從而為新型抗癌藥物的研發(fā)提供了思路[3]。

在目前已發(fā)現(xiàn)的45種Oph同系物中，以O(shè)phA的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，可有效抑制惡性膠質(zhì)瘤[4]、黑色素瘤[5]等多種實(shí)體瘤腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，目前尚未見關(guān)于OphA抗直腸癌活性的研究報(bào)道。本研究旨在探討OphA對(duì)人直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其可能作用機(jī)制，為OphA用于直腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人直腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血 液學(xué)研究所。OphA(>95%, AdipoGen Life Sciences)以乙醇配制成2 mmol/L的母液，使用前以PBS稀釋。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(Sigma-Aldrich Co.)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；細(xì)胞色素C、cleaved caspase-3、Bcl-2、β-actin抗體(Abcam plc.)；磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)、NF-κBp65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抗體(Santa Cruz Bio-technology)；羊抗兔 IgG-HRP、羊抗鼠 IgG-HRP、PBS、DMSO(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；活性氧簇(ROS)檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：SW480細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，以適量0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代比率為 1∶6。

2. 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行。第一部分實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分為四組，分別予PBS和1、5、10 μmol/L OphA作用24 h。第二部分實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分為對(duì)照組、NAC組、OphA組和NAC+OphA組，分別予PBS、NAC(3 mmol/L)、OphA(5 μmol/L)和NAC+OphA作用24 h。

3. MTT實(shí)驗(yàn)：調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，以每孔90 μL細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，孵育過(guò)夜后加入10 μL含OphA和(或)NAC的藥液，使OphA終濃度分別為1、5、10 μmol/L，NAC終濃度為 3 mmol/L，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，倒置顯微鏡(奧林巴斯IX83)下觀察細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，每孔加入MTT試劑20 μL作用4 h，吸去培養(yǎng)基后每孔加入200 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%)。每一樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4. 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，以每孔1 mL細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，孵育過(guò)夜后藥物處理同MTT實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，冰浴避光放置15 min，上流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter EPICS XL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

5. 蛋白質(zhì)印跡法：細(xì)胞處理同MTT實(shí)驗(yàn)。RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每一樣品取20 μg總蛋白上樣，行10% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，4 ℃ 5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜。硝酸纖維素膜經(jīng)與相應(yīng)一抗和二抗反應(yīng)后，ECL顯色、曝光、顯影。ImageJ軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6. 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，藥物處理同MTT實(shí)驗(yàn)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，在細(xì)胞懸液中加入10 μmol/L DCFH-DA (ROS熒光探針)，置于 37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗滌、離心，上流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter CytoFLEX)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS，CytExpert軟件定量分析ROS熒光強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、OphA抑制體外SW480細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

光學(xué)顯微鏡下，OphA作用后部分SW480細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，胞質(zhì)中可見空泡，隨著藥物濃度的增加，更多細(xì)胞發(fā)生破裂(圖1A)。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)終濃度1、5、10 μmol/L的OphA作用24 h，SW480細(xì)胞平均存活率分別為72.3%、54.6%和42.4%，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明OphA有顯著的體外抗直腸癌細(xì)胞增殖作用，增殖抑制作用呈劑量依賴性。流式細(xì)胞分析顯示，經(jīng)終濃度1、5、10 μmol/L的OphA作用24 h，SW480細(xì)胞平均凋亡率分別為6.1%、14.3%和18.7%，與對(duì)照組(2.6%)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1B)，誘導(dǎo)凋亡作用亦呈明顯的劑量依賴性。

二、OphA對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和NF-κB活化的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，經(jīng)1、5、10 μmol/L OphA作用的SW480細(xì)胞，細(xì)胞色素C、cleaved caspase-3、IκBα表達(dá)隨藥物濃度增加而逐步增高，Bcl-2、p-NF-κBp65表達(dá)則隨藥物濃度增加而逐步降低，OphA的作用呈劑量依賴性(圖2)。

A：光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組(0 μmol/L OphA)比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

三、OphA對(duì)SW480細(xì)胞ROS表達(dá)的影響

DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，經(jīng)1、5、10 μmol/L OphA作用24 h，SW480細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平逐步增高，作用呈劑量依賴性(圖3)。

***與對(duì)照組(0 μmol/L OphA)比較，P<0.001

四、NAC對(duì)OphA抑制SW480細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的影響

ROS清除劑NAC(3 mmol/L)對(duì)體外SW480細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，但可阻斷OphA(5 μmol/L)對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制作用(圖4)。同樣，NAC對(duì)SW480細(xì)胞早期凋亡無(wú)明顯影響，但可阻斷OphA的誘導(dǎo)凋亡作用，對(duì)照組、 NAC組、OphA組和NAC+OphA組細(xì)胞凋亡率分別為2.4%、3.1%、14.9%和6.7%，OphA組與NAC+OphA組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

五、NAC對(duì)OphA調(diào)控SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、ROS表達(dá)和NF-κB活化作用的影響

NAC對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C、Bcl-2表達(dá)和NF-κB活化無(wú)明顯影響，但可阻斷OphA對(duì)上述蛋白表達(dá)的調(diào)控作用(圖6)。此外，NAC不僅可下調(diào)ROS在SW480細(xì)胞中的表達(dá)，還可抑制OphA對(duì)ROS表達(dá)的上調(diào)作用(圖7)。

**兩組間比較，P<0.01

***兩組間比較，P<0.001

討 論

直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年我國(guó)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)人民健康造成嚴(yán)重威脅[6]。目前臨床上使用的直腸癌化療藥物均存在較強(qiáng)的毒性反應(yīng)，尋找低毒、高效的抗直腸癌藥物成分或其前體成為當(dāng)前結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究主要觀察OphA對(duì)體外人直腸癌細(xì)胞株SW480生長(zhǎng)和凋亡的影響，并初步探討其可能作用機(jī)制。

圖5 NAC對(duì)OphA誘導(dǎo)凋亡作用的影響

**兩組間比較，P<0.01

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是大多數(shù)化療藥物發(fā)揮抗癌效應(yīng)的主要作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，OphA可有效抑制體外SW480細(xì)胞增殖，作用呈明顯的劑量依賴性，并能劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C作為細(xì)胞呼吸鏈中的一個(gè)重要組分，不僅在氧化還原和能量代謝中扮演重要角色，在線粒體啟動(dòng)凋亡程序中亦發(fā)揮關(guān)鍵的信號(hào)放大作用。其釋放入細(xì)胞質(zhì)后，可特異性地與caspase-9結(jié)合形成凋亡體，激活下游caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞色素C的釋放受Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)[7-9]。本研究觀察到OphA可下調(diào)SW480細(xì)胞中具有抗凋亡作用的Bcl-2表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)到大量細(xì)胞色素C自線粒體中釋放。Caspase-3是caspases家族凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶，經(jīng)OphA作用的SW480細(xì)胞中caspase-3大量激活，cleaved caspase-3表達(dá)呈OphA劑量依賴性上調(diào)，引起細(xì)胞凋亡。

ROS作為機(jī)體代謝過(guò)程中一類具有較強(qiáng)氧化能力的副產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中充當(dāng)?shù)诙攀?，?duì)正常生理反應(yīng)發(fā)揮重要調(diào)控作用。少量ROS可促進(jìn)細(xì)胞分裂，對(duì)細(xì)胞增殖和分化具有一定促進(jìn)作用；高濃度ROS則可直接或間接對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成一定程度的破壞，從而增加線粒體膜通透性，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞衰老，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12]。與正常細(xì)胞相比，高氧化應(yīng)激狀態(tài)多見于腫瘤細(xì)胞，同時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)ROS濃度的變化更為敏感。腫瘤細(xì)胞中諸如過(guò)氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶等抗氧化劑往往表達(dá)上調(diào)，從而將ROS限定在一定濃度以維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定。因此，通過(guò)促氧化劑上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS表達(dá)被認(rèn)為是有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的方式[13-14]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，OphA誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡過(guò)程中伴有ROS表達(dá)上調(diào)，當(dāng)以ROS清除劑NAC清除SW480細(xì)胞內(nèi)的ROS后，OphA對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用被阻斷，OphA對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用亦明顯受抑，表明介導(dǎo)ROS產(chǎn)生和線粒體損傷在OphA誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

NF-κB是一種以異二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子超家族，與IκB結(jié)合時(shí)處于非活性狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子的刺激可使IκB磷酸化進(jìn)而發(fā)生降解，NF-κB與IκB分離后激活，其p65亞基迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)包括Bcl-2家族蛋白在內(nèi)的下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究觀察顯示，OphA可分別下調(diào)和上調(diào)NF-κBp65和IκBα在SW480細(xì)胞中的表達(dá)，而NAC可阻斷 OphA對(duì)兩者表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，提示NF-κB信號(hào)通路可能參與了OphA通過(guò)ROS介導(dǎo)的誘導(dǎo)凋亡作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明OphA對(duì)人直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用依賴于ROS的產(chǎn)生和線粒體凋亡途徑的激活，而NF-κB信號(hào)通路可能參與了ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于揭示直腸癌的發(fā)病機(jī)制以及OphA用于直腸癌的治療有一定積極意義，ROS對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用及其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以明確。