武榮，張俊濤，李衛(wèi)斌，王坤，劉志貞

（1.臨汾職業(yè)技術(shù)學院 預(yù)防醫(yī)學教研室，山西 臨汾 041000；2.山西醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001；3.山西大醫(yī)院 普外科，山西 太原 030032；4.山西省太原市第三人民醫(yī)院 肝病二科，山西 太原 030012）

全世界范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率排第6位，死亡率排第3位[1-2]。微血管密度（microvessel density, MVD）被認為是肝癌和其他癌癥預(yù)后的一個重要指標[3]。AngⅡ 1型受體（angiotensin Ⅱ receptor 1, AT1R）阻抑劑氯沙坦具有抗高血壓的作用[4-5]。黑色素瘤[6]、胰腺癌[7]、腎癌[8]和膀胱癌[9]都表達AT1R。實驗發(fā)現(xiàn)，AT1R拮抗劑可以抑制AT1R表達的腫瘤血管生成，但機制尚不清楚[10]。本實驗檢測癌細胞和大鼠肝癌組織中AT1R的表達，研究氯沙坦對血管生成的作用，從而證明AT1R為肝癌腫瘤血管生成的有效靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AngⅡ、氯沙坦、Hoechst、蛋白提取試劑盒購自美國Sigma公司，胎牛血清、DMEM、MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，AT1R一抗、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）一抗、CD34一抗購自美國Abcam公司，VEGF ELISA kit（美國Pepro Tech公司）。

1.2 細胞

肝癌細胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝細胞LO2購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 實驗動物

健康雄性SD大鼠24只，體重230～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（合格證：C57B/L-B6D2F1/Crl，302），在動物實驗中心無菌培養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)。所做處理均符合鄭州大學動物倫理中心制定的章程。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) HepG2和HuH-7培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，PLC/PRF/5和LO2培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%雙抗MEM培養(yǎng)液中。將其放置于在37℃、5%二氧化碳CO2，相對濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 大鼠肝癌模型的復(fù)制 將24只大鼠麻醉，腹腔注射10%水合氯醛，0.1 ml/只。大鼠取仰臥位，將其四肢固定于實驗板上，用剪子小心剃去胸腹部毛后擦拭安爾碘消毒，沿腹白線逐層開腹，暴露腹腔，輕壓胸腔后，肝臟暴露出腹腔，選取最接近體表的肝葉種植腫瘤。用注射針頭斜行進針，刺入肝臟約1 cm，輕推注射器針芯，緩慢注入細胞懸液20μl，約1×106個HepG2細胞，緩慢退針，用無菌棉簽輕壓片刻后輕送肝臟進入腹腔，逐層關(guān)腹。繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠，待成瘤模型復(fù)制成功后（皮下結(jié)節(jié)直徑＜0.5 cm為成瘤標準），開始給大鼠（其中12只）喂藥氯沙坦（5 mg/kg），持續(xù)給藥2周，處死大鼠，取肝癌組織進行實驗。

1.4.3 Western blot檢測 將肝癌細胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝細胞LO2培養(yǎng)于75 mm2培養(yǎng)瓶中，待細胞長大約90%時，用細胞刮刀刮下，冰上裂解提取蛋白。將HepG2細胞按1×106個/孔接種于6孔板，待細胞長到對數(shù)生長期時，分別添加0、1、10、100和1 000 nmol/L AngⅡ，100 nmol/L AngⅡ＋0.1μmol/L氯沙坦，100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦，1 000 nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦，培養(yǎng)24 h。用細胞刮刀刮下細胞，冰上裂解提取蛋白，用二喹啉甲酸法測定每組蛋白質(zhì)濃度，總蛋白上樣量為35μg/孔，上完樣后進行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜（80 V，90 min），5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜5 min/次，共5次。分別用一抗 AT1R（1 ∶ 500）、GAPDH（1 ∶ 1 000）4℃過夜，TBST洗膜5 min/次，共5次。用稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗37℃搖床反應(yīng)1 h，TBST洗膜5 min/次，共5次。采用ECL試劑盒進行顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照后，用Lab Works 4.6軟件進行灰度值分析。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 將 HepG2細胞按 1×106個 /孔接種于6孔板，細胞貼壁12 h后，用無血清的DMEM培養(yǎng)12 h，添加100 nmol/L AngⅡ、100 nmol/L AngⅡ＋0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦、1 000nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦，培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)液于離心管中，3 500 r/min離心10 min，取上清液。VEGF的檢測按照VEGF ELISA kit試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 免疫組織化學法 取大鼠肝癌組織制成切片，將切片固定于載玻片上干燥處理。將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中進行脫蠟，然后逐級放置于100%純酒精Ⅰ、Ⅱ，95%、80%和70%酒精，以及水中各5 min，進行水化。水化后的切片放于3%雙氧水 H2O2中室溫孵育10 min，PBS洗滌3次。將切片放入檸檬酸緩沖液（0.01 nmol/L，pH 6.0）中，加熱至沸騰改中火（＞92℃），室溫下復(fù)溫，PBS洗滌3次。吸干多余液體，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min。分別滴加AT1R（1 ∶ 300）、VEGF（1 ∶ 800）和 CD34（1 ∶ 600）一抗4℃過夜，取出后在37℃烤箱中復(fù)溫30 min，PBST洗3次。滴加生物素抗兔二抗，37℃孵育1 min，PBST洗滌3次。用DAB試劑盒顯色10 min，顯色終止后清洗切片。滴加蘇木精室溫染液3 min，清水洗掉蘇木精染液，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍5 min。將切片分別放入70%和80%酒精各1 min，90%酒精2 min，95%酒精3 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各3 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，取出晾干后用中性樹膠封片。每個標本以只滴加PBS液作為陰性對照，在顯微鏡下觀察各切片著色情況。

1.4.6 免疫熒光染色 將蓋玻片放到6孔板中，肝癌細胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝細胞LO2均按1×105個/ml接種于6孔板中，待細胞長至80%時，棄上清，PBS洗3次，10 min/次。4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min，PBS洗3次，添加0.1%Triton X-100細胞打孔，1%胎牛血清白蛋白封閉，加入AT1R（1∶500）抗體4℃過夜，PBS洗3次，加入FITC標記的羊抗鼠二抗和Hoechst，室溫孵育1 h，將蓋玻片放到載玻片上，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AT1R在各細胞系中的表達

熒光顯微鏡下觀察AT1R在肝癌細胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝細胞LO2中的表達，發(fā)現(xiàn)AT1R在正常肝細胞LO2中綠色熒光強度低，而在肝癌細胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5中綠色熒光強度高，在HepG2細胞中綠色熒光最強，即AT1R在HepG2細胞中表達最高。見圖1。

圖1 AT1R在各細胞系中的表達 （熒光顯微鏡×100）

2.2 AT1R蛋白在各細胞系中的表達

為進一步證明熒光顯微鏡的觀察結(jié)果，采用Western blot檢測AT1R在肝癌細胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝細胞LO2中的表達，其相對表達量分別為（1.00±0.03）、（0.37±0.02）、（0.36±0.02）、（0.11±0.02），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=829.274，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，AT1R在正常肝細胞LO2中低表達，在肝癌細胞系HepG2中高表達（t=1.874，P=0.008），在HuH-7和PLC/PRF/5中高表達（t=1.272和 1.568，P=0.032 和 0.019）。見圖2。

圖2 AT1R蛋白在各細胞系中的表達 （±s）

2.3 氯沙坦對肝癌細胞系HepG2中AT1R蛋白表達的影響

上述實驗表明AT1R在肝癌細胞系HepG2中表達最高，故進一步用Western blot檢測氯沙坦對肝癌細胞系HepG2中AT1R表達的影響。0、1、10、100和1 000 nmol/L AngⅡ濃度組的AT1R蛋白相對表達量分別為（0.10±0.01）、（0.14±0.02）、（0.25±0.03）、（0.36±0.03）、（0.51±0.03），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=131.774，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，0 nmol/L與1 nmol/L AngⅡ比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.325，P=0.078）；與0 nmol/L AngⅡ相比，從10 nmol/L AngⅡ開始，隨著AngⅡ濃度增加，AT1R蛋白表達量逐漸升高（t=1.643、3.428和 2.953，P=0.014、0.000 和 0.000）。見圖3。

圖3 不同濃度AngⅡ?qū)Ω伟┘毎礖epG2中AT1R蛋白的表達的影響 （±s）

0 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦、1 000 nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦組的AT1R 相對表達量分別為（0.21±0.02）、（0.84±0.03）、（0.52±0.02）、（0.31±0.03）、（0.29±0.03），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=281.878，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦組相比，隨著氯沙坦?jié)舛仍黾?，AT1R蛋白表達水平逐漸降低（t=2.953、4.058和3.194，均P=0.000）。見圖4。

2.4 氯沙坦對肝癌細胞系HepG2中VEGF的影響

圖4 不同濃度AngⅡ＋氯沙坦對肝癌細胞系HepG2中AT1R蛋白表達的影響 （±s）

AngⅡ ＋ 0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ ＋0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦、1 000 nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦組的VEGF表達量分別為（730.1±10.0）、（806.6±18.1）、（789.0±12.0）、（780.8±1.0）、（769.7±1.0），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.322，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦組較0 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦組的VEGF表達量增加（t=1.215，P=0.041）；與100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦組比較，當氯沙坦的濃度為1.0μmol/L時，VEGF的表達量降低（t=1.383，P=0.030）；當氯沙坦的濃度為10.0μmol/L時，VEGF的表達量進一步降低（t=1.407，P=0.028）。見圖5。

2.5 氯沙坦對大鼠肝癌組織中AT1R、VEGF及CD34表達的影響

免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示，氯沙坦對AT1R、VEGF及CD34的表達有較明顯的影響（見圖6）。對照組和氯沙坦組的AT1R陽性表達率分別為（62.07±3.86）%和（43.57±4.21）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=1.920，P=0.034），氯沙坦組較低（見圖7）。對照組和氯沙坦組的VEGF陽性表達率分別為（57.38±6.16）%和（19.87±3.29）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.963，P=0.000），氯沙坦組較低（見圖8）。對照組和氯沙坦組的AT1R陽性表達率分別為（56.83±5.17）%和（17.56±3.12）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.536，P=0.000），氯沙坦組較低（見圖9）。

圖5 氯沙坦對肝癌細胞系HepG2中VEGF的影響 （±s）

圖6 大鼠肝癌組織中AT1R、VEGF及CD34的陽性表達 （免疫組織化學法×800）

圖7 氯沙坦對大鼠肝癌組織中AT1R表達的影響 （±s）

圖8 氯沙坦對大鼠肝癌組織中VEGF表達的影響 （±s）

圖9 氯沙坦對大鼠肝癌組織中CD34表達的影響 （±s）

3 討論

AT1R在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌等各種惡性腫瘤中表達[11]。有報道表明，AT1R參與多種動物模型中腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。但是在人肝癌細胞中，AT1R的表達報道甚少。FAN等[13]證明，AT1R在肝癌細胞系中高表達，其與肝癌的血管生成相關(guān)。本研究通過體內(nèi)外實驗證明AT1R阻斷劑氯沙坦對肝癌血管生成的影響。免疫組織化學法結(jié)果表明，肝癌細胞中均有AT1R的表達，同時VEGF在肝癌細胞中的表達趨勢與AT1R一致。VEGF是由腫瘤細胞分泌的、重要的血管生成刺激因子，同時VEGF的表達與肝癌預(yù)后有關(guān)。通過上調(diào)VEGF可以刺激血管的生成，AngⅡ通過與G蛋白偶聯(lián)受體AT1R結(jié)合，介導很多細胞效應(yīng)。因此，AngⅡ-AT1R-VEGF系統(tǒng)在控制肝癌細胞血管生成中有重要作用。

除了VEGF，腫瘤內(nèi)的MVD也是評估惡性腫瘤患者預(yù)后的重要定量參數(shù)。CD31、CD34、vWF為鑒定MVD的上皮細胞特異性標志[14]。MVD與AT1R的表達呈正相關(guān)，約70%高MVD樣本中，AT1R有高表達現(xiàn)象。MVD可以有效反映腫瘤血管的生成。并且MVD的增加與VEGF表達呈正相關(guān)[15]。筆者推測，AT1R對肝癌血管的生成具有重要作用，所以AT1R對調(diào)節(jié)VEGF-A具有重要作用。血管生成已成為藥物治療的一個重要的靶點，許多血管生成抑制藥物已經(jīng)用于臨床。在本研究中，AngⅡ通過上調(diào)AT1R蛋白表達來促進肝癌細胞中VEGF的產(chǎn)生，同時氯沙坦可以抑制該現(xiàn)象。本研究同時證明，氯沙坦可以有效抑制腫瘤的生長和VEGF的表達。作為AT1R的抑制劑，氯沙坦可以抑制體內(nèi)固體瘤的生長，這種抑制可能是通過抑制血管生成介導的。

AT1R參與癌細胞增殖。但是SUGANUMA等[16]實驗表明，AngⅡ不能有效地促進卵巢癌細胞的增殖。同時在本實驗中，AngⅡ可以增加VEGF的分泌，AT1R也許沒有直接參與肝癌細胞的增殖，并且血管緊張素Ⅱ-AT1R體系在不同類型腫瘤細胞的發(fā)展過程中也起到不同的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，AT1R表達于肝癌細胞中，并與腫瘤血管生成有關(guān)。AT1R的抑制劑可以抑制實驗動物模型中腫瘤血管的生成。盡管如此，AT1R阻抑劑氯沙坦的實驗結(jié)果表明，氯沙坦既無直接的毒性作用，也無抗增殖的作用。根據(jù)體內(nèi)外實驗結(jié)果，筆者將氯沙坦的抗腫瘤作用歸結(jié)于抗血管的生成作用，而不是直接的毒性作用。AT1R不僅是一個很有潛力的預(yù)后指示因子，而且是肝癌治療的一個重要靶點。