王姍姍，王莉，程媛媛，范艷，王菲迪，吳聲敢

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建培育基地農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥 殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

草莓以其味道鮮美、色澤艷麗、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受我國(guó)人民的喜愛。草莓栽培容易、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、收益好，近年來已成為農(nóng)民增加收入的主要途徑。草莓主要采用設(shè)施栽培方式進(jìn)行種植，而設(shè)施大棚內(nèi)高溫高濕環(huán)境增加了病蟲害發(fā)生的概率[1]。據(jù)調(diào)查，浙江省草莓病害主要有16種、蟲害有18種[2]。由于草莓病蟲害發(fā)生種類多，農(nóng)戶必須使用不同的農(nóng)藥進(jìn)行防治。據(jù)統(tǒng)計(jì)，草莓生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥有56種，其中殺菌劑有吡唑醚菌酯等33種，吡蟲啉等殺蟲劑16種，丁草胺等除草劑3種及蕓苔素內(nèi)酯等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑5種[3]。同時(shí)，為減少施藥次數(shù)，節(jié)省勞動(dòng)力，農(nóng)戶常一次使用多種農(nóng)藥進(jìn)行防治，易導(dǎo)致草莓農(nóng)藥產(chǎn)生多殘留現(xiàn)象[4-6]。隨著生活水平的提高，食品安全問題得到了人們的普遍關(guān)注。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確穩(wěn)定、可用于草莓多殘留檢測(cè)的方法具有重要的意義。

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)因具有高通量、高靈敏度、分析時(shí)間短、極佳的選擇性和去除干擾能力等優(yōu)點(diǎn)，已成為草莓樣品農(nóng)藥殘留檢測(cè)的有力工具[5-10]。QuEChERS前處理方法因具有簡(jiǎn)單、快速、回收率高、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)，在草莓樣品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中也得到了廣泛應(yīng)用[4,6-8,10]。但已有研究結(jié)果顯示，草莓樣品一次檢測(cè)最多只有35種農(nóng)藥[9]，不能滿足當(dāng)前草莓農(nóng)藥殘留檢測(cè)需求。因此，迫切需要開發(fā)一種農(nóng)藥多檢測(cè)檢測(cè)方法，其檢測(cè)參數(shù)應(yīng)涵蓋當(dāng)前草莓生產(chǎn)上使用的農(nóng)藥及將來可能使用的農(nóng)藥。本研究采用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法建立了草莓中啶酰菌胺、嘧菌環(huán)胺、多菌靈、聯(lián)苯肼酯等85種農(nóng)藥殘留同時(shí)測(cè)定的方法，以期為草莓產(chǎn)品質(zhì)量安全和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LCMS-8050超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，Phenomenex Luna? Omega C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.6 μm，美國(guó)菲羅門公司)，AB104-S電子天平(感量0.000 1 g，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)，OHAUS SPS202F型電子天平(感量0.01 g，奧豪斯儀器常州有限公司)，TYZD-IIA振蕩器(姜堰市天儀電子儀器有限公司)，Sigma 3-18k高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，TD5A-WS離心機(jī)(金壇市金南儀器制造有限公司)，移液槍，容量瓶，藥勺，50 mL PPTE離心管等。

色譜純乙腈(Merck公司)，飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，色譜純甲酸(Anaqua Chemicals Supply公司)，分析純氯化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，分析純無水硫酸鎂(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，Cleanert MAS-QuEChERS(MS-9PP0250，C1850 mg，PSA 50 mg，PC 50 mg，MgSO4150 mg，天津博納艾杰爾科技有限公司)等。

標(biāo)準(zhǔn)品為85種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)溶液，均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司和上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 樣品提取與凈化

稱取10 g草莓樣品于50 mL PPTE離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩器上以200 rpm的轉(zhuǎn)速振蕩30 min后，加入3 g氯化鈉和5 g無水硫酸鎂，劇烈手搖30 s。然后將盛裝樣品的離心管在離心機(jī)離心5 min (離心力RCF=1 006g)，取1.5 mL上清液轉(zhuǎn)入含有50 mg PSA+50 mg C18+150 mg MgSO4的2 mL離心管。充分振蕩混勻后將混合液離心3 min(離心力RCF=7 155g)，吸取上清液0.5 mL過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.3 UPLC-MS/MS分析

1.3.1 液相條件

色譜柱為Phenomenex Luna? Omega C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.6 μm，美國(guó)菲羅門公司)，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液梯度洗脫(表1)，流速0.2 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積5.00 μL，峰面積外標(biāo)法定量。

表1 高效液相色譜梯度洗脫參數(shù)

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧質(zhì)譜正離子模式(ESI+)，三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，毛細(xì)管電壓4.0 kV，霧化氣流量3.0 L·min-1，加熱氣流量10.0 L·min-1，Heat Block溫度400 ℃，DL 溫度250 ℃，Interface溫度300 ℃。85種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2～4。

表2 氧樂果等供試農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

注：*代表定量離子，表3～4同。

表3 百克威等供試農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

表4 甲拌磷等供試農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。分別準(zhǔn)確稱取85種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈溶解并配制成一定濃度的單個(gè)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光保存，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度均大于500 mg·L-1，有效期為1年。

10 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。準(zhǔn)確移取相應(yīng)體積的85種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用色譜純乙腈定容，得到濃度為10 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下避光保存，有效期為1個(gè)月。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，將草莓空白樣品按照1.2節(jié)方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到濃度為0.5、1、5、10、50、100、500 μg·L-1的系列匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3條件測(cè)定，以待測(cè)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 添加回收試驗(yàn)

選取草莓空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，驗(yàn)證該快速檢測(cè)方法的回收率，并考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。85種農(nóng)藥在草莓中的添加水平均為5，50和200 μg·kg-1，每個(gè)濃度水平重復(fù)5次，按1.2節(jié)方法進(jìn)行處理，1.3節(jié)條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

試驗(yàn)對(duì)比了Phenomenex Luna? Omega C18(2.1 mm×50 mm，1.6 μm)和Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)兩種色譜柱的分離效果及化合物的儀器響應(yīng)。結(jié)果表明，85種化合物在2根柱子上均有較好的峰型和重現(xiàn)性，但85種化合物在使用Phenomenex Luna? Omega C18色譜柱時(shí)儀器響應(yīng)普遍高于ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱，因此最終選擇Phenomenex Luna? Omega C18色譜柱分離待測(cè)物。試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液和0.1%的甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相，待測(cè)物的分離度和峰型均較好，且化合物的響應(yīng)也有明顯的增強(qiáng)效果。

2.2 凈化管的選擇

凈化管的組成和含量是影響樣品前處理效果的重要因素。試驗(yàn)對(duì)比2種凈化管，一種為C1850 mg，PSA 50 mg，MgSO4150 mg，另一種在前一種凈化管的基礎(chǔ)上增加石墨化炭(GCB)50 mg。結(jié)果表明，當(dāng)添加GCB時(shí)嘧菌環(huán)胺、吡唑醚菌酯、阿維菌素等農(nóng)藥的回收率小于70%，推測(cè)GCB對(duì)這些具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥有一定的吸附作用，從而造成添加回收率偏低，而不添加GCB時(shí)，85種農(nóng)藥的添加回收率均大于70%，滿足農(nóng)藥定量分析的要求[11]。

2.3 方法的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

在0.5～500 μg·L-1范圍內(nèi)，85種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.994 5。檢出限為評(píng)價(jià)方法靈敏度的指標(biāo)。以信噪比等于3對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物濃度作為方法的檢出限(表5～6)。

選取空白草莓樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。以回收率表示方法的準(zhǔn)確度，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的精密度。由表7～8可知，在5，50和200 μg·kg-1的添加水平下，平均回收率為70.2%～109.0%，RSD為0.23%～13.90%(n=5)。除蕓苔素內(nèi)酯的定量限為50 μg·kg-1外，其余84種農(nóng)藥均為最低一檔添加濃度5 μg·kg-1。

表5 氧樂果等農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表6 氟酰胺等農(nóng)藥的質(zhì)線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表7 氧樂果等農(nóng)藥在草莓中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表8 氯蟲苯甲酰胺等農(nóng)藥在草莓中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差

3 小結(jié)

本研究采用QuEchERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了草莓中85種農(nóng)藥殘留同時(shí)測(cè)定的方法。方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度等各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，適用于草莓中該85種農(nóng)藥的同時(shí)測(cè)定。