王 瑤 李 琪 李平蘭

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

0 引言

乳酸細(xì)菌素是乳酸菌在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中通過核糖體機(jī)制合成，并分泌到菌體體外的一類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)，細(xì)菌素具有無抗藥性、無毒副作用及易被人體降解的特點，因此不僅是一種天然的食品防腐保鮮劑[1-2]，而且具有取代抗生素的潛力[3]。目前已經(jīng)報道了許多新的細(xì)菌素及產(chǎn)生菌(如植物乳桿菌LPL-1的植物乳桿菌素LPL-1[4]、動物雙歧桿菌B04的bifidocin A[5]與類植物乳桿菌L-ZS9的paraplantaricin L-ZB1[6]等)，但其細(xì)菌素的產(chǎn)量嚴(yán)重制約了其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是食品發(fā)酵工業(yè)中常見的益生菌，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于奶制品、肉制品及果蔬發(fā)酵食品中[7-9]。產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌不僅具有益生特性，而且具有抑菌特性，因此在食品發(fā)酵與食品防腐保鮮領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

植物乳桿菌LPL-1(LactobacillusplantarumLPL-1)不僅是一株新的菌種，而且所產(chǎn)細(xì)菌素為新的IIa類細(xì)菌素，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力[4]，然而菌體自身所產(chǎn)細(xì)菌素的產(chǎn)量比較低，其合成不僅受到自身誘導(dǎo)肽的調(diào)控，而且與培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件有關(guān)[10]。本文以植物乳桿菌LPL-1為研究對象，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌素LPL-1的培養(yǎng)基組分，獲得該菌種產(chǎn)生細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)基組成，為該菌種產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)細(xì)菌素提供一定的實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基及試劑

植物乳桿菌LPL-1分離自發(fā)酵魚，指示菌單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 54002由實驗室保存。MRS培養(yǎng)基(葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、吐溫-80體積比1 mL/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度2 g/L、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.1 g/L、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L、蒸餾水體積1 L)各組成成分購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 細(xì)菌素提取

按照1%接種量將植物乳桿菌LPL-1接種至100 mL MRS培養(yǎng)基，37℃靜止培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心15 min收集上清液，按照培養(yǎng)基與-20℃預(yù)冷丙酮體積比1∶3進(jìn)行配比，-20℃放置1 h取出，8 000 r/min離心15 min收集沉淀，后用-20℃預(yù)冷的丙酮等體積洗滌脫水，8 000 r/min離心15 min收集沉淀，沉淀室溫(20℃)干燥用于計算酶活力。

1.3 抑菌活性的檢測

采用牛津杯雙層平板擴(kuò)散法測定細(xì)菌素的酶活性[11]。將提取的細(xì)菌素進(jìn)行2倍稀釋，取樣100 μL進(jìn)行抑菌試驗，觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為1個活力單位，其倒數(shù)即是原液的細(xì)菌素相對抑菌效價，單位為AU/mL。

相對抑菌效價標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將已知相對抑菌效價的細(xì)菌素稀釋為80%、60%、40%與20%，分別取100 μL進(jìn)行抑菌試驗，以對應(yīng)抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，相對抑菌效價對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 單因素試驗

選擇不同碳源、氮源、刺激因子、磷酸鹽緩沖液及二價離子作為影響抑菌活性的主要因素，通過單因素試驗選擇Plackett-Burman(PB)試驗的影響因素與水平。

1.4.1碳源

分別采用2%的葡萄糖、蔗糖、α-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉及麥芽糖作為MRS培養(yǎng)基碳源成分，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗證。

1.4.2氮源

分別采用1%的酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨及硝酸鈉作為MRS培養(yǎng)基氮源成分，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗證。

1.4.3刺激因子

分別采用1 mL/L 的吐溫(Tween)-20、吐溫-60、吐溫-80、聚乙二醇(PEG)-1000、PEG-4000與PEG-8000作為MRS培養(yǎng)基刺激因子，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗證。

1.4.4緩沖液

分別采用2 g/L的K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4與NaH2PO4作為MRS培養(yǎng)基緩沖成分，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗證。

1.4.5二價離子

分別采用0.2 g/L的MgSO4、MnSO4、ZnSO4、FeSO4與CuSO4作為MRS培養(yǎng)基緩沖成分，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗證。

1.5 Plackett-Burman試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 10.0設(shè)計Plackett-Burman試驗(N=12)。具體設(shè)計及相應(yīng)區(qū)間如表1所示，根據(jù)各因素的貢獻(xiàn)率與P值確定主要影響因素。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計Tab.1 Design of Plackett-Burman experiment

1.6 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗分析的顯著性、貢獻(xiàn)率及效應(yīng)值設(shè)計試驗的方向與步長。最陡爬坡試驗具體設(shè)計方案如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗設(shè)計Tab.2 Design of the steepest grade test

1.7 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

由最陡爬坡試驗的拐點確定響應(yīng)面試驗的中心點及相應(yīng)區(qū)間，采用Design-Expert 10.0軟件設(shè)計試驗方案，優(yōu)化葡萄糖、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與吐溫-80體積比，以相對抑菌效價為響應(yīng)值進(jìn)行17組試驗，具體設(shè)計方案如表3所示。模型對酶活力進(jìn)行二次多元回歸擬合，生成等高線圖與響應(yīng)面曲線圖，獲得最佳發(fā)酵參數(shù)，對模型進(jìn)行方差分析，確定其可信度。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計Tab.3 Design of Box-Behnken experiment

1.8 模型的驗證

利用響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行發(fā)酵試驗，比較模型預(yù)測值與試驗值，驗證模型的有效性。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗重復(fù)3次，取平均值。采用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析與顯著性差異分析，Design-Expert 10.0進(jìn)行Plackett-Burman與Box-Behnken試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1碳源

碳源是菌體代謝與生長的主要元素，不同碳源對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)植物乳桿菌素LPL-1的影響如圖1所示(圖中不同字母表示差異顯著，下同)。Lb.plantarumLPL-1可以利用多種碳源，方差結(jié)果顯示不同種類的碳源對細(xì)菌素的活性具有顯著性影響(P<0.05)。以葡萄糖為碳源時，所獲得細(xì)菌素相對抑菌效價達(dá)到286.67 AU/mL，明顯高于其它碳源。由于不同碳源的結(jié)構(gòu)不同，Lb.plantarumLPL-1對蔗糖、半乳糖、乳糖、淀粉與麥芽糖利用率比較低，因此確定葡萄糖為Lb.plantarumLPL-1產(chǎn)植物乳桿菌素LPL-1的最佳碳源。

圖1 碳源對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.1 Influence of carbon source on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

不同類型乳酸菌利用碳源的差異性比較大，如戊糖乳桿菌31-1[12]、植物乳桿菌ST23LD[13]與酸乳片球菌C20[14]的最佳碳源分別為乳糖、山梨醇與麥芽糖。本文的最優(yōu)碳源是葡萄糖，導(dǎo)致菌體利用不同碳源的原因可能是菌體來源、所處的生長環(huán)境及內(nèi)部代謝途徑的不同。

2.1.2氮源

氮源是微生物合成的主要因素，可以分為有機(jī)氮源與無機(jī)氮源。有機(jī)氮源被微生物酶解為小分子物質(zhì)，被菌體吸收轉(zhuǎn)化后進(jìn)一步合成代謝，最終形成菌體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)；無機(jī)氮源不僅可以調(diào)節(jié)外部環(huán)境的pH值，而且可以參與菌體的代謝，但是其利用速率比較快[15]。本文利用有機(jī)氮源與無機(jī)氮源不同組合，測定菌體產(chǎn)乳桿菌素 LPL-1的活性，結(jié)果如圖2所示，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更能促進(jìn)乳桿菌素LPL-1的產(chǎn)生，有機(jī)氮源降解的營養(yǎng)成分有可能促進(jìn)了細(xì)菌素合成蛋白的表達(dá)。方差結(jié)果顯示，酵母粉與胰蛋白胨更能促進(jìn)細(xì)菌素的合成，但是兩者之間差異不顯著，復(fù)合氮源的使用可以更大提高細(xì)菌素的活性，因此采用不同氮源比例(胰蛋白胨與酵母粉質(zhì)量比)1∶1、1∶2、2∶1進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果如圖3所示。

圖2 氮源對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.2 Influence of nitrogen source on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

圖3 氮源質(zhì)量比對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.3 Influence of nitrogen ratio on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

由圖3可知，氮源比例為2∶1時，乳桿菌素LPL-1相對抑菌效價最高，因此，確定最優(yōu)氮源比例為2∶1，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行Plackett-Burman與響應(yīng)面試驗。

2.1.3刺激因子

刺激因子主要是表面活性劑類的物質(zhì)，它可以影響細(xì)胞膜的通透性[16]，進(jìn)而影響細(xì)菌素的合成與分泌，不同種類的刺激因子對乳桿菌素LPL-1的影響如圖4所示，不同刺激因子對細(xì)菌素的產(chǎn)生差異性明顯(P<0.05)，吐溫-80為刺激因子時，細(xì)菌素的相對抑菌效價達(dá)到310.83 AU/mL，明顯高于其它刺激因子(P<0.05)，因此確定吐溫-80為最佳刺激因子。

圖4 刺激因子對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.4 Influence of surfactants on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

GARVER等[17]初步證實了吐溫-80對細(xì)菌素影響的重要性；莊緒亮等[18]研究了吐溫-80對Nisin產(chǎn)生的影響，確定了吐溫-80對細(xì)菌的產(chǎn)生具有刺激作用；本文同樣初步證明了吐溫-80對植物乳桿菌素活性的影響。

2.1.4二價離子

二價離子通常作為酶反應(yīng)活性中心的輔基，對菌體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯具有重要影響[19]，不同種類的二價離子對細(xì)菌素活性的影響如圖5所示，不同離子對細(xì)菌素的產(chǎn)生差異性明顯(P<0.05)，硫酸鎂與硫酸錳對細(xì)菌素活性影響明顯，因此確定其為最佳影響因子。

圖5 二價離子對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.5 Influence of divalentions on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

2.1.5緩沖液

在培養(yǎng)基體系中，緩沖液主要起到穩(wěn)定pH值作用[20]，促進(jìn)菌體生長，同時磷又是菌體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)與能量等主要營養(yǎng)物質(zhì)的組成元素，因此本文分析了不同緩沖體系對細(xì)菌素活性的影響，結(jié)果如圖6所示，磷酸氫二鉀為細(xì)菌素發(fā)酵最佳緩沖液，方差分析結(jié)果顯示，緩沖液之間對該細(xì)菌素的活性影響差異并不顯著(P>0.05)，在后期的Plackett-Burman試驗中，選擇磷酸氫二鉀作為考察因素進(jìn)行重復(fù)驗證。

圖6 緩沖液對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.6 Influence of buffer on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

2.2 Plackett-Burman試驗

以單因素試驗為基礎(chǔ)，根據(jù)Plackett-Burman試驗的貢獻(xiàn)率與顯著性確定主要影響因素，為后續(xù)的Box-Behnken響應(yīng)面試驗奠定基礎(chǔ)。以葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、吐溫-80體積比(C)、硫酸錳質(zhì)量濃度(D)、硫酸鎂質(zhì)量濃度(E)與磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度(F)為考察因素(A～F為編碼值)，設(shè)置-1與1的不同水平(表4、5)，以相對抑菌效價為響應(yīng)值(表4)，利用Design-Expert 10.0進(jìn)行設(shè)計與分析，結(jié)果如表4與表5所示。根據(jù)Design-Expert 10.0數(shù)據(jù)分析，模型方差P<0.05，說明數(shù)據(jù)模型具有可信度，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)與吐溫-80體積比(C)貢獻(xiàn)率最高，并且具有顯著性差異，因此，選擇以上3個因素進(jìn)行最陡爬坡試驗確定中心點，同時磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為正效應(yīng)，硫酸鎂質(zhì)量濃度為負(fù)效應(yīng)，硫酸錳質(zhì)量濃度為正效應(yīng)，因此，選擇磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 g/L，硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.3 g/L，其余因素按照培養(yǎng)基初始比例進(jìn)行添加，牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L。

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果Tab.4 Results of Plackett-Burman experiment

表5 Plackett-Burman試驗效應(yīng)分析Tab.5 Effect analysis of Plackett-Burman experiment

2.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果設(shè)計主要因素的最陡爬坡試驗，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、吐溫-80體積比為顯著因素。根據(jù)這3個因素的取值高低水平、效應(yīng)值，以細(xì)菌素相對抑菌效價為響應(yīng)值，設(shè)定這3個因素的變化方向及步長。最陡爬坡試驗結(jié)果呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在3號試驗點(表2)處出現(xiàn)最高點，該點處葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、吐溫-80體積比為1 mL/L，此時植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素相對抑菌效價達(dá)到最大，最大值為583.23 AU/mL。該點即為下一步Box-Behnken試驗設(shè)計的中心點。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

利用Design-Expert 10.0軟件對葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、吐溫-80體積比設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗結(jié)果見表6。對Box-Behnken試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表7可知，所選擇的回歸模型的P值小于0.05，表明整體模型對試驗結(jié)果具有顯著的影響，具有可信度；而失擬項的P值為0.299，大于0.05，失擬項檢驗不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果的影響較小，殘差主要由隨機(jī)誤差引起，模型選擇適當(dāng)；該模型的相關(guān)系數(shù)R=0.983 8，校正相關(guān)系數(shù)0.963 0，信噪比大于4，表明模型可信度很高。細(xì)菌素相對抑菌效價Y對葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和吐溫-80體積比的多元二次回歸方程為

表6 Box-Behnken試驗結(jié)果Tab.6 Results of Box-Behnken experiment

Y=784.458+89.629 2A+24.669 4B+30.500 6C-25.151 7AB-0.153 076AC+21.458BC-274.751A2-223.076B2-326.02C2

注：** 表示P<0.01。

圖7 Box-Behnken試驗的響應(yīng)面三維圖和等高線圖Fig.7 Response surface three-dimensional diagrams and counter maps of Box-Behnken experiments

2.5 響應(yīng)面立體分析及等高線圖

由回歸方程所做的響應(yīng)面立體圖與等高線圖如圖7所示，主要反映了葡萄糖、酵母粉與吐溫-80之間的相互作用，通過方程可知，二次項系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 10.0分析計算，最適發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51%與吐溫-80體積比1.02 mL/L，由于胰蛋白胨與酵母粉的最優(yōu)質(zhì)量比為2∶1，因此胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為1.02%，此時最大相對抑菌效價為793.21 AU/mL。

2.6 回歸模型的驗證

為了驗證回歸方程的準(zhǔn)確性，利用優(yōu)化后培養(yǎng)基的條件(葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51%、胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.02%、牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、吐溫-80體積比1.02 mL/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 g/L、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.3 g/L、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L、蒸餾水體積1 L)進(jìn)行3次重復(fù)性驗證，細(xì)菌素的平均相對抑菌效價為(752.11±4.98) AU/mL，與預(yù)測值的擬合率達(dá)到94.7%，表明預(yù)測值與實際值具有良好的擬合性，優(yōu)化后培養(yǎng)基可用，同時優(yōu)化后細(xì)菌素相對抑菌效價(752.11 AU/mL)比優(yōu)化前(286.67 AU/mL)提高了1.62倍，說明本試驗優(yōu)化的培養(yǎng)基明顯提高了細(xì)菌素的產(chǎn)量。

3 結(jié)束語

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗確定了主要影響因素為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與吐溫-80體積比，最陡爬坡試驗確定了中心點，響應(yīng)面Box-Behnken試驗建立了二次多項式回歸模型，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51%、胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.02%、牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、吐溫-80體積比1.02 mL/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 g/L、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.3 g/L、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L、蒸餾水體積1 L。在此條件下細(xì)菌素相對抑菌效價(752.11 AU/mL)比優(yōu)化前(286.67 AU/mL)提高了1.62倍。