崔 憲 郭建斌 徐 艷 溫嘯宇 龐昌樂 董仁杰，2

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院， 煙臺 264670)

0 引言

玉米秸稈是我國主要農(nóng)業(yè)廢棄物之一，據(jù)統(tǒng)計，2015年其產(chǎn)量達(dá)2.65億t[1]。作為一種可再生生物質(zhì)資源，秸稈可作為多種生物質(zhì)能源(如沼氣、氫氣及生物乙醇等)生產(chǎn)的原料[2]。由于秸稈的生產(chǎn)具有季節(jié)性，有效貯存是保證規(guī)模化沼氣工程全年穩(wěn)定運(yùn)行的前提。濕貯存技術(shù)較干貯存具有干物質(zhì)損失低和可降低火災(zāi)危害等優(yōu)點(diǎn)，在歐洲被廣泛應(yīng)用于沼氣工程的原料貯存環(huán)節(jié)[3]，經(jīng)過濕貯存的玉米秸稈產(chǎn)甲烷潛力可提高3%～15%[4-5]。然而在我國秸稈優(yōu)先用于肥料化、飼料化[6]，用于沼氣工程的秸稈風(fēng)干程度不一，理化性質(zhì)迥異，尤其當(dāng)原料可溶性糖不足時，會嚴(yán)重影響玉米秸稈的貯存品質(zhì)[7]。研究表明原料至少含3%的可溶性糖才能獲得優(yōu)質(zhì)貯存料[7]，所以調(diào)控干黃秸稈貯存過程是發(fā)展秸稈沼氣工程的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。目前，國內(nèi)外主要通過補(bǔ)充添加劑來改善秸稈貯存品質(zhì)，如營養(yǎng)強(qiáng)化劑(葡萄糖、蔗糖)[8-9]、發(fā)酵促進(jìn)劑(乳酸菌、纖維素酶)[10-11]和發(fā)酵抑制劑(甲酸、乙酸)[12-13]。研究內(nèi)容主要集中在青貯飼料生產(chǎn)領(lǐng)域，而關(guān)于干黃玉米秸稈沼氣工程貯存領(lǐng)域研究較少。

本文以干黃玉米秸稈為原料，通過添加葡萄糖及其與同型乳酸菌(植物乳桿菌)、異型乳酸菌(短乳桿菌)和乙酸協(xié)同調(diào)控貯存過程，系統(tǒng)分析不同添加劑對原料貯存品質(zhì)、細(xì)菌多樣性以及產(chǎn)甲烷潛力的影響，為沼氣工程秸稈原料的高效貯存提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與菌劑

玉米秸稈于2016年10月取自河南省鞏義市，品種為豐玉2號，為鮮食玉米品種。收獲后玉米秸稈含水率較高，呈青色，在自然條件下風(fēng)干20 d左右后呈干黃色，粉碎至1～3 cm的長度后運(yùn)送至實驗室進(jìn)行后續(xù)試驗。試驗所用的干黃玉米秸稈理化性質(zhì)見表1。

表1 干黃玉米秸稈與接種污泥的化學(xué)組成性質(zhì)Tab.1 Chemical composition of corn stover and inoculated sludge

原料產(chǎn)氣潛力測試的接種污泥取自北京城市污水處理廠，過10目篩除去沙粒，置于37℃的恒溫水浴鍋中，保持污泥活性，接種污泥的性質(zhì)見表1。

同型乳酸菌(植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum))與異型乳酸菌(短乳桿菌(Lactobacillusbrevis))均購自于日本生物資源中心(NBRC)，菌株編號分別為15891與107147。MRS培養(yǎng)基(青島海博生物公司)用于菌種活化，MRS瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物公司)用于活菌計數(shù)。

1.2 濕貯存原料調(diào)制與試驗設(shè)計

將添加劑溶于一定量水中，均勻噴灑至準(zhǔn)確稱取的50 g干黃玉米秸稈上，調(diào)整體系含水率至65%。將調(diào)制好的各組秸稈分裝至聚乙烯袋中(尺寸：250 mm×300 mm)，用真空包裝機(jī)抽真空并熱封處理后，放置于人工氣候箱(溫度28℃，無光照，相對濕度65%)濕貯存30 d，分別選取第0、3、7、15、30天時動態(tài)分析化學(xué)組分與發(fā)酵品質(zhì)。

共設(shè)計5個試驗組進(jìn)行濕貯存：空白組(Con組)，無添加劑的干黃玉米秸稈；單一葡萄糖組(Glu組)，葡萄糖添加量為原料(含水率65%)的3%；葡萄糖植物乳桿菌協(xié)同組(LP組)，葡萄糖添加量為原料(含水率65%)的3%，植物乳桿菌接種量為原料干基的1×106CFU/g；葡萄糖短乳桿菌協(xié)同組(LB組)，葡萄糖添加量為原料(含水率65%)的3%，短乳桿菌接種量為1×106CFU/g(以原料干基計)；葡萄糖乙酸協(xié)同組(AA組)，葡萄糖和乙酸添加量分別為原料(含水率65%)的3%和0.4%。

1.3 細(xì)菌多樣性研究

在無菌環(huán)境下，準(zhǔn)備空白組貯存0 d (Con 0)與30 d (Con 30) 樣品以及其余4組濕貯存30 d樣品(Glu 30、LP 30、LB 30、AA 30)各10 g，與90 mL無菌生理鹽水混合，37℃恒溫振蕩2 h得到微生物菌懸液，用孔徑0.22 μm無菌濾膜過濾得到微生物菌體。用滅菌手術(shù)剪剪碎，將整張帶有菌體的濾膜置于2 mL無菌離心管中，使用E.Z.N.A土壤DNA提取試劑盒進(jìn)行微生物DNA提取，檢測合格后送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq測序。

PCR擴(kuò)增選擇擴(kuò)增區(qū)域為16S rDNA V4-V5，所用引物為338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)。根據(jù)Illumina MiSeq測序平臺的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行雙端(2×300 bp)測序，得到2×300 bp的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行生物信息學(xué)分析、多樣性分析和物種組成分析。

1.4 厭氧消化試驗設(shè)計

厭氧消化試驗分別選取5個試驗組濕貯存30 d的樣品，共計5組進(jìn)行試驗。設(shè)計僅接種污泥處理組，用于計算污泥產(chǎn)氣量和秸稈產(chǎn)氣凈產(chǎn)量。

該批次厭氧發(fā)酵試驗于帶有一次性鋁蓋的120 mL玻璃發(fā)酵瓶中進(jìn)行。污泥與玉米秸稈的添加量(基于揮發(fā)性固體質(zhì)量)之比為2∶1，將污泥與秸稈加入發(fā)酵瓶中，充分混勻后，充入氮?dú)猓S后立即蓋好硅膠塞，標(biāo)號后置于37℃恒溫水浴鍋中。試驗期間使用玻璃注射器測量日均產(chǎn)氣量，并分析計算累積產(chǎn)氣量。產(chǎn)氣潛能用修正的Gompertz模型進(jìn)行擬合[5]，公式為

式中p——扣除空白的t時刻的單位揮發(fā)性固體累積氣體產(chǎn)量，mL/g

p0——單位揮發(fā)性固體最大產(chǎn)能潛能，mL/g

Rmax——單位揮發(fā)性固體最大產(chǎn)甲烷速率，mL/(g·d)

λ——遲滯期，d

t——試驗持續(xù)時間，d

1.5 分析方法

總固體含量測定采用105℃干燥恒重法、揮發(fā)性固體含量測定采用550℃灼燒恒重法。原料濕貯存后會產(chǎn)生大量有機(jī)酸，在105℃條件下進(jìn)行總固體含量測定時有機(jī)酸揮發(fā)會引起測定結(jié)果偏低。因而，本文根據(jù)KREUGER等[14]報道的濕貯存原料在100℃下干燥時不同有機(jī)酸的揮發(fā)系數(shù)進(jìn)行修正。pH值使用Orin 5-Star 型pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)測定。半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量采用Van Soest Fiber分析方法，使用ANKOM A200型纖維分析儀(USA)進(jìn)行測定。沼氣成分(CH4和CO2)由SP-2100型氣相色譜儀(北瑞利分析儀器有限公司，中國)測出，揮發(fā)性脂肪酸與乙醇含量采用日本島津公司生產(chǎn)的GC-2010Plus型氣相色譜儀測定，乳酸含量采用美國戴安公司生產(chǎn)的Dionex Ultimate U3000型高效液相色譜儀測定，測定方法詳見文獻(xiàn)[5]。

1.6 試驗方法

數(shù)據(jù)用Origin 8.5軟件整理制圖并利用修正的Gompertz方程擬合累積產(chǎn)氣曲線。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異，P>0.05代表數(shù)據(jù)不存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 濕貯存過程中理化特性及發(fā)酵產(chǎn)物動態(tài)分析

圖1 秸稈濕貯存過程發(fā)酵品質(zhì)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of fermentation quality during wet storage

濕貯存過程中pH值、干物質(zhì)損失率及可溶性碳水化合物含量的變化如圖1a～1c所示。Con組濕貯存過程中pH值呈現(xiàn)先緩慢下降后升高的趨勢，但在貯存期間pH值始終維持在6以上。干物質(zhì)損失率隨貯存時間的延長而增大，在貯存30 d時，干物質(zhì)損失率為10%。初始可溶性碳水化合物占總固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為1.6%，貯存過程中略有降低。Glu組在貯存3 d時pH值已低至4.8，在貯存30 d時pH值達(dá)到4.2，干物質(zhì)損失率為4.7%，與Con組相比，干物質(zhì)損失下降53%。與Glu組相比，LP組與LB組可加速發(fā)酵初期(3 d內(nèi))pH值下降速率及可溶性碳水化合物消耗；而貯存30 d時pH值和可溶性碳水化合物含量無顯著變化(P>0.05)，LP組干物質(zhì)損失率為4.6%，與Glu組相比無顯著變化(P>0.05)，LB組干物質(zhì)損失率為5.5%，略高于Glu組，是由于接種短乳桿菌屬于異型乳酸菌，會產(chǎn)生二氧化碳造成少量干物質(zhì)損失[15-16]。AA組初始pH值為6.75，貯存30 d時pH值為4.0，干物質(zhì)損失率為3.6%，均顯著低于其他組(P<0.05)?？扇苄蕴妓衔锍跗谙妮^少，隨著貯存時間的延長，可溶性碳水化合物含量呈線性下降趨勢。pH值是最直接表征秸稈濕貯存效果的指標(biāo)。秸稈pH值為4.1～4.3，質(zhì)量良好；pH值為4.4～5.0，質(zhì)量一般；pH值在5.0以上，質(zhì)量劣等[17]，pH值越低秸稈濕貯存的效果越好，穩(wěn)定貯存的時間越長?？瞻捉M的秸稈濕貯存品質(zhì)較差，是由于其缺少可被乳酸菌直接利用的可溶性碳水化合物，導(dǎo)致乳酸、乙酸等有機(jī)酸含量低，pH值偏高，不能有效地抑制腐敗菌(梭菌、芽孢桿菌、酵母菌等)分解有機(jī)物，產(chǎn)生二氧化碳或氨氣等造成大量干物質(zhì)損失[18]。其余組均添加了葡萄糖，貯存30 d均獲得質(zhì)量良好的原料，干物質(zhì)損失顯著下降(P<0.05)。

濕貯存過程中木質(zhì)纖維素的變化見表2。Con組在貯存過程中，木質(zhì)纖維素組分幾乎沒有顯著變化。其余4組纖維素和半纖維素含量在數(shù)值上均有下降趨勢，Glu 組纖維素含量貯存30 d時顯著降低(P<0.05)，LP組、LB組和AA組貯存30 d的半纖維素含量顯著低于貯存0 d(P<0.05)，所有組木質(zhì)素含量均無顯著變化(P>0.05)，濕貯存過程中秸稈長時間在低pH值的酸性環(huán)境，促進(jìn)了部分纖維素、半纖維素的降解，這與劉桂要[7]的研究結(jié)果基本一致。與Glu組相比，額外添加乳酸菌與乙酸對纖維素、半纖維素含量無顯著影響，HEIERMANN等[4]研究也表明乳酸菌對青貯玉米秸稈的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維無顯著影響。

濕貯存過程中乳酸含量的變化見圖1d。Con組乳酸含量初期略有升高，貯存15～30 d期間干基質(zhì)量比維持在14 g/kg。Glu組乳酸含量呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，貯存至30 d時干基質(zhì)量比為36 g/kg。與Glu 組相比，LP組呈現(xiàn)初期快速增加后期略有降低趨勢，貯存至30 d時達(dá)到62 g/kg，乳酸含量顯著提高(P<0.05)，F(xiàn)ILYA等[19]研究也表明接種植物乳桿菌可顯著提高乳酸含量；LB組貯存至30 d時，乳酸含量的干基質(zhì)量比達(dá)到44 g/kg；AA組乳酸含量在發(fā)酵初期(7 d內(nèi))并無明顯增加，但發(fā)酵后期呈迅速升高趨勢，發(fā)酵至30 d時乳酸的干基質(zhì)量比高達(dá)75 g/kg，顯著高于其他組(P<0.05)。由圖1c可發(fā)現(xiàn)，可溶性碳水化合物在發(fā)酵7 d后迅速被消耗，可以推測由于直接添加乙酸導(dǎo)致pH值快速降低，抑制了部分微生物活性，減少了貯存初期對可溶性碳水化合物的消耗，但隨著發(fā)酵時間的延長，可在酸性環(huán)境下生長的乳酸菌大量繁殖，快速消耗可溶性碳水化合物產(chǎn)生大量有機(jī)酸。

表2 秸稈濕貯存過程纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的動態(tài)變化Tab.2 Dynamic changes of cellulose, hemicellulose and lignin during wet storage

注：同列不同小寫字母表示相同處理組不同時間差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示相同時間不同處理間差異顯著(P<0.05)。

濕貯存過程中乙酸含量的變化見圖1e。Glu組與LP組貯存30 d時，乙酸的干基質(zhì)量比分別為5 g/kg和6 g/kg，與Con組相比，并未顯著增加(P>0.05)。而LB組在貯存3 d后，乙酸含量呈現(xiàn)先顯著升高后平穩(wěn)的趨勢，貯存30 d時，乙酸的干基質(zhì)量比達(dá)到12 g/kg，是由于短乳桿菌屬于異型乳酸菌，代謝產(chǎn)物除了乳酸外，還有乙酸等。KLEINSCHMIT[20]研究表明玉米青貯料接種異型乳酸菌可提高乙酸含量。AA組在貯存30 d時，乙酸的干基質(zhì)量比為20 g/kg,貯存期間乙酸含量的變化與乳酸含量的變化相一致，原因也相近。

濕貯存過程中丙酸、丁酸和乙醇含量的變化見圖1f～1h。5個濕貯存組丙酸含量的干基質(zhì)量比均低于2 g/kg。Glu組、LP組、LB組和AA組丁酸的干基質(zhì)量比均低于2 g/kg。Con組在貯存15 d后，丁酸含量迅速增長，貯存30 d時干基質(zhì)量比已高達(dá)29 g/kg，這是由梭狀芽胞桿菌大量繁殖產(chǎn)生二次發(fā)酵導(dǎo)致的。據(jù)徐春城[21]報道，大多數(shù)梭菌通常出現(xiàn)在濕貯存后期，高pH值、低可溶性碳水化合物含量均有助于梭菌的繁殖，其在無氧條件下能分解單糖、雙糖、乳酸、淀粉、纖維素以及有機(jī)氮化物等產(chǎn)生丁酸、二氧化碳與氫氣等造成營養(yǎng)物質(zhì)大量損失。LP組、LB組、AA組的乙醇含量均顯著低于Con組與GLu組(P<0.05)。在貯存過程中，乙醇一般是乳酸菌、腸桿菌、酵母等微生物的代謝產(chǎn)物[21]，Con組的pH值較高，乙醇可能是腸桿菌或酵母的代謝產(chǎn)物，Glu組的pH值較低，可能是某些異型發(fā)酵乳酸菌的代謝產(chǎn)物。與LP組和LB組相比，AA組貯存7 d后，乙醇含量顯著升高(P<0.05)，結(jié)合乳酸和乙酸含量變化，推測添加乙酸可能促進(jìn)了某些異型乳酸菌的生長。

2.2 濕貯存前后細(xì)菌多樣性變化分析

原料濕貯存前后化學(xué)組分及發(fā)酵品質(zhì)的變化本質(zhì)上是微生物菌群共同作用的結(jié)果。選取空白組貯存的0 d和30 d，其余4組貯存30 d的原料進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，分別為：Con 0、Con 30、Glu 30、LP 30、LB 30、AA 30。

由圖2a可知，干黃玉米秸稈原料主要附著變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，豐度分別為50.05%、16.88%和24.66%，少量厚壁菌門(Firmicutes)和未定名Saccharibacteria的豐度分別為5.32%和2.45%，極少量藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，四者豐度之和僅為0.59%。其余5組均是經(jīng)過濕貯存，厚壁菌門豐度顯著升高(P<0.05)，成為主要優(yōu)勢菌群，放線菌門顯著升高(P<0.05)。變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和Saccharibacteria豐度顯著降低(P<0.05)，這與陶蓮等[22]的研究結(jié)果一致。

由圖2b可知，干黃玉米秸稈(Con 0組)主要附著鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、單胞菌(Luteimonas)等，豐度分別為20.54%、7.72%、6.37%、5.22%、4.99%。還有少量乳酸菌，如乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)等，豐度均低于0.5%，非乳酸菌屬豐度高達(dá)99%。

圖2 濕貯存前后門水平、屬水平的細(xì)菌群落組成Fig.2 Composition of bacterial community at phylum and genus before and after wet storage

Con 30組，主要附著Weissella、Bacillus、Enterococcus、Pediococcus、Saccharomonospora、Nocardiopsis、Clostridiums.s，豐度分別為15.62%、8.75%、10.42%、7.35%、5.27%、5.53%、3.34%。Weissella、Enterococcus、Pediococcus等乳酸菌成為優(yōu)勢菌群。但對貯存更有利的Lactobacillus并未升高。KUNG[23]表明Pediococcus比Lactobacillus更適宜在高干物質(zhì)及較高pH值的條件下生長。同時Clostridiums.s的豐度達(dá)到3.34%，而其余組的豐度均低于0.1%。這表明大量的梭菌繁殖，會發(fā)生丁酸發(fā)酵，造成干物質(zhì)損失。這也是圖1g中Con組的丁酸含量顯著高于其他組的原因。

Glu 30組，主要優(yōu)勢菌群Lactobacillus、Bacillus、Enterococcus、Enterobacter、Pediococcus，豐度分別為11.11%、11.22%、9.01%、5.32%、6.88%。以乳桿菌屬、腸球?qū)?、片球菌屬等乳酸菌為主?dǎo)產(chǎn)酸，這與PAHLOW等[24]研究一致。一般來說桿菌比球菌更耐酸性[21]，Glu組貯存30 d時pH值為4.2，腸球?qū)倥c片球?qū)僖咽艿揭种疲a(chǎn)酸緩慢，但乳桿菌并不占據(jù)絕對的主導(dǎo)地位，這也是Glu組的乳酸含量遠(yuǎn)低于LP組的原因。同時腐敗菌Enterobacter豐度依然較高，會產(chǎn)生乙醇，這可能是Glu組乙醇含量高于LP組、LB組與AA組的原因。

LP 30組，主要優(yōu)勢菌群為Lactobacillus和Bacillus，豐度分別為41.07%、8.27%。乳桿菌屬占乳酸菌的99%。乳桿菌較其他乳酸菌更適宜在酸性環(huán)境下生存，產(chǎn)酸速率更快。與Glu 30組相比，乳桿菌屬相對豐度顯著升高(P<0.05),結(jié)合乳酸含量變化(圖1d)，推測這株同型發(fā)酵的植物乳桿菌在玉米秸稈濕貯存環(huán)境中較適宜生長，腐敗菌Enterobacter、Clostridiums.s等相對豐度均顯著下降(P<0.05)。

LB 30組，主要優(yōu)勢菌群為Lactobacillus和Bacillus，豐度分別為14.45%、13.17%，與Glu組相比，Lactobacillus豐度僅提高3.3%，與LP 30組相比，顯著下降(P<0.05)，可能是接種量不足或這株短乳桿菌不適合在這種環(huán)境中生長。但腐敗菌Enterobacter、Clostridiums.s相對豐度低于LP 30組，表明短乳桿菌與植物乳桿菌相比，可降低腐敗菌的相對豐度，任海偉等[25]表明接種異型乳酸菌可有效抑制腐敗菌。

AA 30組，主要優(yōu)勢菌群為Weissella、Bacillus和Lactobacillus，豐度分別為16.87%、14.97%、9.32%。與Glu 30組、LP 30組和LB 30 組相比，Lactobacillus相對豐度最低，而Weissella相對豐度最高，可見添加乙酸可能促進(jìn)了Weissella生長，Weissella屬于異型發(fā)酵，主要產(chǎn)物有乳酸、乙酸或乙醇。這可能是AA組貯存7 d后乳酸、乙酸和乙醇含量升高的原因(圖1d～1h)。同時Enterobacter與Clostridiums.s相對豐度顯著低于其他組(P<0.05)，表明添加乙酸強(qiáng)化了以Weissella為主導(dǎo)的異型發(fā)酵過程并抑制了腐敗菌生長，增強(qiáng)了貯存過程穩(wěn)定性。

2.3 濕貯存前后厭氧消化性能以及產(chǎn)氣動力學(xué)分析

厭氧消化是多種微生物協(xié)同在厭氧環(huán)境下將有機(jī)物逐漸分解，產(chǎn)生甲烷這一能源物質(zhì)的過程。已有研究表明玉米秸稈經(jīng)過濕貯存可提高秸稈產(chǎn)氣潛力[4]，為了進(jìn)一步探討復(fù)合添加劑對經(jīng)過濕貯存的干黃玉米秸稈產(chǎn)氣潛力的影響，選取了5組濕貯存試驗貯存30 d的樣品進(jìn)行產(chǎn)氣潛力試驗，結(jié)果如圖3所示。

圖3 干黃玉米秸稈補(bǔ)充添加劑濕貯存后的產(chǎn)氣潛力分析Fig.3 Methane production comparison of dry corn stover with additive after wet storage

Con 30組測定單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量(264±1) mL/g。Glu 30組測定單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(293±6) mL/g，其中每克葡萄糖理論產(chǎn)氣量為373 mL[26]，除去每克原料中額外添加的葡萄糖理論產(chǎn)氣量，經(jīng)過計算Glu組中秸稈自身理論單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(282±7) mL/g(計算理論值時，均不考慮添加劑損失)，與Con 30組相比，提高秸稈自身產(chǎn)甲烷潛力6.8%。

LP 30組測定單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(289±7) mL/g，與Glu 30組相比，無顯著變化(P>0.05)，MENARDO等[27]研究表明全株玉米秸稈接種同型乳酸菌對甲烷產(chǎn)氣潛力無顯著影響。菌劑添加量低于0.1 mL，對產(chǎn)氣幾乎無影響，除去葡萄糖的理論產(chǎn)氣量，秸稈自身理論單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(274±7) mL/g，與Con 30組相比，略有升高。

LB 30組測定單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(282±3) mL/g，與Glu 30組相比略有降低。ZHAO等[28]研究，以柳枝稷為原料接種短乳桿菌，貯存30 d后甲烷產(chǎn)量顯著升高。HAAG等[29]研究，全株玉米接種異型乳酸菌貯存后對甲烷產(chǎn)量無顯著影響。這可能與原料理化特性、乳酸菌生長情況有關(guān)，短乳桿菌異型發(fā)酵會產(chǎn)生二氧化碳，造成部分有機(jī)物的損失，導(dǎo)致測定產(chǎn)甲烷潛力的降低。除去葡萄糖理論產(chǎn)氣量，秸稈自身理論單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(270±3) mL/g，與Con 30組相比，略有升高。

AA 30組測定單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(299±1) mL/g，與Glu 30組相比，無顯著變化(P>0.05)。除去葡萄糖與乙酸理論產(chǎn)氣量[29]，秸稈自身理論單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量為(287±1) mL/g，與Con 30組相比，提高秸稈自身產(chǎn)甲烷潛力8.7%。

采用修正Gompertz 方程對5組玉米秸稈厭氧消化過程進(jìn)行擬合預(yù)測，其中Rmax、單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量以及延滯期λ是反映厭氧消化效率的重要指標(biāo)。結(jié)果如表3所示，5組決定系數(shù)R2均不小于0.98，表明方程對5組試驗的厭氧消化過程有較好的擬合。Con 30組的延滯期為2.75 d，其余4組的延滯期均明顯縮短，主要是由于原料添加葡萄糖經(jīng)過濕貯存后產(chǎn)生的有機(jī)酸，加速厭氧消化過程中產(chǎn)甲烷菌的代謝過程，縮短了啟動延滯時間。AA組的延滯期小于0.01 d，可能是由直接添加乙酸，乙酸可作為產(chǎn)甲烷菌的直接底物導(dǎo)致的。添加劑可顯著縮短濕貯存干黃玉米秸稈的延滯期，有利于提高實際沼氣工程的產(chǎn)甲烷效率和綜合效益。采用修正Gompertz 模型得到的單位揮發(fā)性固體累積甲烷產(chǎn)量的預(yù)測值略低于批次實驗得到測定值，差異比范圍為4%～7%。這表明修正Gompertz 模型可以較好模擬補(bǔ)充了添加劑的濕貯存干黃玉米秸稈的厭氧消化過程。

表3 修正Gompertz方程預(yù)測的玉米秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Model estimation results of dry corn stover after storage by modified Gompertz models

添加劑調(diào)控玉米秸稈濕貯存過程，使得玉米秸稈產(chǎn)氣潛力得以提高，主要?dú)w結(jié)于兩方面原因，首先通過添加葡萄糖，增加了乳酸菌可利用底物濃度，快速產(chǎn)生乳酸，降低了秸稈貯存過程的pH值，抑制了腐敗菌生長，降低干物質(zhì)損失，更好地保存了營養(yǎng)物質(zhì)。其次是木質(zhì)纖維素長時間在低pH值的酸性環(huán)境中，部分纖維素、半纖維素降解為厭氧消化過程中易水解物質(zhì)，木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)得以改變，使得秸稈的產(chǎn)氣潛力得以改善[30-31]。葡萄糖協(xié)同乳酸菌或乙酸添加分別起到調(diào)控有機(jī)酸分布和增強(qiáng)貯存過程穩(wěn)定性的作用，其對進(jìn)一步提高秸稈產(chǎn)氣潛力的作用有限。

可見以干黃玉米秸稈為沼氣工程原料時，外源糖的補(bǔ)充是保證其高效貯存及產(chǎn)氣的關(guān)鍵。在實際工程應(yīng)用中，為充分利用廢棄物資源、降低工程運(yùn)營成本，建議可結(jié)合當(dāng)?shù)貙嶋H情況，適當(dāng)補(bǔ)充含糖量高的工業(yè)或農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行混貯方式，例如糖蜜、蘋果渣等。

3 結(jié)論

(1)以干黃玉米秸稈為原料，添加葡萄糖經(jīng)過濕貯存后，可快速降低原料pH值，與空白組相比，干物質(zhì)損失下降53%，并使?jié)褓A存快速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，秸稈產(chǎn)氣潛力提高6.8%。

(2)葡萄糖與植物乳桿菌或短乳桿菌的協(xié)同添加，可加速貯存過程的進(jìn)行，使乳酸或乙酸含量快速增加。但其對原料產(chǎn)氣潛力并無進(jìn)一步促進(jìn)作用。

(3)葡萄糖與乙酸協(xié)同添加，乳酸與乙酸含量大量增多，提高了異型乳酸發(fā)酵魏斯氏菌屬的相對豐度，有效抑制腐敗菌的生長，秸稈產(chǎn)氣潛力提高8.7%。

(4)綜合分析貯存品質(zhì)及產(chǎn)氣潛力，以干黃玉米秸稈為沼氣工程原料時，外源糖的補(bǔ)充是保證其高效貯存及產(chǎn)氣的關(guān)鍵，協(xié)同添加乙酸可有效改善其濕貯存品質(zhì)，并抑制腐敗菌生長，強(qiáng)化濕貯存過程穩(wěn)定性。