翟崇宇 陳俊強(qiáng) 王震 黎伯培 毛遠(yuǎn)天

【摘要】目的 研究臨床常用化療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶及塞來(lái)昔布聯(lián)合應(yīng)用模式對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡行為的影響，并分析上述藥物治療過(guò)程中可能涉及的分子機(jī)制。方法 采用AnnexinV-PE和7-AAD雙染模式予以流式細(xì)胞技術(shù)評(píng)定順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來(lái)昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組這些處理組胃癌細(xì)胞的凋亡行為情況。結(jié)果 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，在藥物作用于胃癌細(xì)胞株SGC-79012天后，順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來(lái)昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組的細(xì)胞凋亡率分別為（7.10±0.30）%、（46.53±1.50）%、（39.17±1.10）%、（66.93±0.70）%、（62.13±1.60）%，均明顯高于參照組，數(shù)據(jù)存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來(lái)昔布組與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加，組間差異性顯著（P<0.05）。結(jié)論 與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，順鉑+塞來(lái)昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組治療模式能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，這一研究結(jié)果顯示順鉑、5-氟尿嘧啶及塞來(lái)昔布聯(lián)合應(yīng)用模式具有協(xié)同抗胃癌的作用。

【關(guān)鍵詞】胃癌；化療藥物；細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞技術(shù)

【中圖分類號(hào)】R735.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2018.19..03

Effect of cisplatin，5-fluorouracil combined with celecoxib on the apoptosis of gastric cancer cell line SGC-7901

ZHAI Chong-yu，CHEN Jun-qiang*，WANG Zhen，LI Bo-pei，MAO Yuan-tian

（The first affiliated hospital of guangxi medical university，Guangxi Nanning 530021，China）

【Abstract】Objective To study the effect of chemotherapeutic drugs cisplatin， 5-fluorouracil and celecoxib on the apoptotic behavior of gastric cancer cell line SGC-7901， and to analyze the possible molecular mechanisms involved in the above drug treatment.Methods The apoptotic behavior of cisplatin group， 5- fluorouracil group， cisplatin + celecoxib group and 5- fluorouracil + celecoxib group were evaluated by flow cytometry with AnnexinV-PE and 7-AAD double staining mode. Results Flow cytometry results showed that after the drug was applied to the gastric cancer cell line SGC-79012， the cells of the cisplatin group， 5-fluorouracil group， cisplatin+celecoxib group， and 5-fluorouracil+celecoxib group were observed. The apoptotic rates were（7.10±0.30）%，（46.53±1.50）%，（39.17±1.10）%，（66.93±0.70）%，and（62.13±1.60）%，respectively， which were significantly higher than the reference group.The data were statistically significant（P<0.05）；found at the same time： combined 5-fluorouracil group， cisplatin +celecoxib group and cisplatin group，5-fluorouracil group， the rate of apoptosis significantly increased， the difference between the groups was significant（P<0.05）.Conclusion Compared with the cisplatin and 5-fluorouracil groups， the cisplatin+celecoxib group and the 5-fluorouracil+celecoxib group can promote gastric cancer cell apoptosis.This result showed that cisplatin，5- The combination of fluorouracil and celecoxib has a synergistic anti-gastric effect.

【Key words】Gastric cancer；Chemotherapy；Apoptosis；Flow cytometry

胃癌（gastric carcinoma）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，多發(fā)于年齡50歲以上的男性。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新發(fā)胃癌病例大約在42.7萬(wàn)，而每年死亡病例約30萬(wàn)[1]，現(xiàn)已成為我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。胃癌早期無(wú)明顯癥狀，可存在輕微腹部不適，臨床誤診和漏診幾率大。而大多數(shù)胃癌在確診時(shí)已相對(duì)嚴(yán)重，導(dǎo)致無(wú)法單純使用手術(shù)進(jìn)行治療。為此，如何尋找胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于提高胃癌對(duì)化療藥物的敏感性以及臨床效果非常重要。既往研究顯示，環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程有直接的關(guān)系。其誘導(dǎo)生成的前列腺素E2（PGE2）可在一定程度上與相關(guān)受體進(jìn)行結(jié)合，從而促進(jìn)Bcl-1基因的表達(dá)，達(dá)到抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)的目的，減少胃癌細(xì)胞的凋亡[2]。近期有研究顯示，COX-2的選擇性抑制劑塞來(lái)昔布可有效地抑制胃癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)同時(shí)可以在憶當(dāng)年程度上抑制胃癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡[3]。基于此，本次研究通過(guò)細(xì)胞流式技術(shù)觀察順鉑與5-氟尿嘧啶同塞來(lái)昔布聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡行為的影響，并探討其可能涉及的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901材料于中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫(kù)采購(gòu)。

1.2 儀器與材料

RPMI-1640培養(yǎng)液與標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibco，USA）；青霉素-鏈霉素混合液（碧云天公司，中國(guó)上海）；順鉑（齊魯制藥有限公司，中國(guó)）；5-氟尿嘧啶及塞來(lái)昔布（Aladdin，USA）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD，USA）；二甲基亞砜（DMSO）（Solarbio，USA）；PBS磷酸鹽緩沖液（干粉）（索萊寶科技有限公司，中國(guó)北京）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma，USA）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及吸管（Corning，USA）；電熱恒溫

水浴箱（上海醫(yī)療器械廠，中國(guó)）；流式細(xì)胞儀（BD，USA）。

1.3 方法

1.3.1 胃癌細(xì)胞SGC-7901的培養(yǎng)及藥物處理

（1）將冷凍儲(chǔ)存的胃癌細(xì)胞株SGC-7901，在1分鐘內(nèi)予以溶解，將胃癌細(xì)胞株SGC-7901溶解懸液置入培養(yǎng)基之中，并吹勻，以800 rpm進(jìn)行離心處理，時(shí)間約為3分鐘。

（2）保留胃癌細(xì)胞株SGC-7901懸液沉淀，應(yīng)用培養(yǎng)基再次制備成為懸液，同時(shí)根據(jù)胃癌細(xì)胞的具體狀態(tài)，將5滴細(xì)胞懸液與4 ml培養(yǎng)基進(jìn)行水平十字混合，保持37℃之中培養(yǎng)24小時(shí)。

（3）用1×PBS清洗細(xì)胞后更換培養(yǎng)基，混入約6 ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，一般每24～48 h更換一次。

（4）采用電子顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞株SGC-7901，如胃癌細(xì)胞占屏80%以上后，進(jìn)行傳代。

（5）細(xì)胞懸液混合新培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)。

（6）觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，將其分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組（參照組、順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來(lái)昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組），同時(shí)建立6個(gè)藥物濃度梯度[4，5]對(duì)各組細(xì)胞分別進(jìn)行的藥物作用處理。找到順鉑組、5-氟尿嘧啶組及塞來(lái)昔布組的半數(shù)抑制濃度分別為10.43±0.27 mg/L、156.56±2.07 mg/L、92.04±4.93 umol/L。

1.3.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同藥物治療模式下胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡情況

將各組經(jīng)半數(shù)抑制濃度作用24 h后的胃癌細(xì)胞株SGC-7901采用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，檢測(cè)中可在消化時(shí)混入2%牛血清白蛋白，避免消化過(guò)度而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在偏差。在標(biāo)記前用1×緩沖液清洗胃癌細(xì)胞，去除細(xì)胞中的牛血清白蛋白，保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

a.將貼于培養(yǎng)皿壁的胃癌細(xì)胞取下，于室溫條件下進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速：2000 rpm時(shí)間：5～10分鐘；

b.再次用1×緩沖液清洗胃癌細(xì)胞，于室溫條件下進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速：2000 rpm時(shí)間：5～10分鐘；

c.將300 μl1×緩沖液與細(xì)胞混合；

d.采用5 μlAnnexin V-FITC試劑與細(xì)胞懸液充分混合，室溫下靜置15～20分鐘（需予以避光處理）；

e.應(yīng)用200 μl1×緩沖液與細(xì)胞懸液充分混合；

f.將5 μlPI制劑與細(xì)胞懸液充分混合，予以檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，采用例數(shù)（n）百分?jǐn)?shù)（%）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，以“x±s”表示，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

參照組、順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來(lái)昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡率分別為（7.10±0.30）%、（46.53±1.50）%、（39.17±1.10）%、（66.93±0.70）%、（62.13±1.60）%；與參照組相比，各組凋亡率明顯增加（P<0.05），且順鉑+塞來(lái)昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增殖（P<0.05）。（表1、圖1、圖2）

3 討 論

順鉑和5-氟尿嘧啶藥品是臨床常用化療藥物，前者通過(guò)和腫瘤細(xì)胞中DNA結(jié)合，形成交叉鍵，進(jìn)而對(duì)DNA復(fù)制行為起到了破壞作用。5-氟尿嘧啶藥物的胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制是通過(guò)藥物抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而使胃癌細(xì)胞DNA的合成行為受到抑制，促使胃癌細(xì)胞逐漸凋亡。但是，在臨床治療過(guò)程中，患者極易出現(xiàn)耐藥問(wèn)題，致使胃癌患者化療效果難以保障，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐苫颊呋熓。瑖?yán)重威脅患者生命安全[6，7]。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究胃癌臨床化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡行為，以便于保證患者化療效果。塞來(lái)昔布藥物作為一種非特異性環(huán)氧化酶抑制劑，具有抗炎、解熱或鎮(zhèn)痛等臨床作用，也成為胃癌患者臨床治療的藥劑。

近年來(lái)，研究非特異性環(huán)氧化酶抑制劑在胃癌臨床治療中的研究成果較少，尤其是與化療藥物相互聯(lián)合應(yīng)用方面。Tendo M、Yashiro M等人[8]采用胃癌腹膜轉(zhuǎn)移裸鼠模型化療藥物與非特異性環(huán)氧化酶抑制劑作用的影響，其結(jié)果顯示經(jīng)口予非特異性環(huán)氧化酶抑制劑JTE-522與S-1聯(lián)合應(yīng)用于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移治療效果較好，說(shuō)明非特異性環(huán)氧化酶抑制劑與S-1聯(lián)合應(yīng)用模式具有臨床治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的價(jià)值。Chen M、Yu L等人[9]研究結(jié)果表明，非特異性環(huán)氧化酶抑制劑能夠避免胃癌患者順鉑發(fā)生耐藥反應(yīng)，但是在裸鼠移植瘤模型研究結(jié)果中顯示，塞來(lái)昔布和順鉑聯(lián)合模式的胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡效果并未予以凸顯。鑒于此，究竟化療藥與COX-2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用能否提高胃癌的化療效果目前仍存在爭(zhēng)議。塞來(lái)昔布作為非特異性環(huán)氧化酶抑制劑的代表性藥物，其抗胃癌效果較為明顯。本研究結(jié)果顯示，與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，順鉑+塞來(lái)昔布組、

5-氟尿嘧啶+塞來(lái)昔布組治療效果較好，藥物在聯(lián)合作用后能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡行為，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)藥物敏感性。

綜上所述，順鉑、5-氟尿嘧啶聯(lián)合塞來(lái)昔布用藥相較于單一用藥可以進(jìn)一步促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，但是否與P53、蛋白激酶A、AKT、Fas、Bcl-2/Bax、Bak、caspase-9等蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)及相關(guān)通路有關(guān)需進(jìn)一步研究。

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本文編輯：吳宏艷