付彩霞，余紅波，鄒濤，陳雄，陳世貴，李欣，*

（1.發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北宜都443302）

我國是柑橘生產(chǎn)大國，柑橘產(chǎn)量和種植面積均是世界第一[1]。然而，柑橘在我國主要是以鮮果的形式進行銷售[2]。大量柑橘集中上市，一方面導(dǎo)致賣柑難和價格波動大，另一面未售出的柑橘腐爛后導(dǎo)致嚴重的資源損失。這種局面的形成主要是由于我國柑橘加工利用途徑狹窄且加工能力薄弱。當前，柑橘果汁、柑橘罐頭和柑橘發(fā)酵果醋是3種主要的柑橘加工產(chǎn)品[3－4]。橘片罐頭是我國柑橘加工一個非常重要的項目，其加工量占柑橘加工的80%以上，但產(chǎn)品科技附加值低。柑橘果醋酸度過強導(dǎo)致口感不佳，還未被消費者廣泛接受?？梢姡_拓柑橘加工利用新途徑，研制新型柑橘發(fā)酵飲料，對于多渠道消化果品和調(diào)節(jié)豐缺，增加柑橘資源利用率，延長產(chǎn)業(yè)鏈，提升柑橘產(chǎn)業(yè)科技含量，都有積極的意義。由于柑橘自身的含糖量偏低，不足以支撐微生物發(fā)酵對碳源的需求。因此，本項目以柑橘濃縮汁為唯一發(fā)酵組份，利用魯氏酵母菌的糖醇轉(zhuǎn)化及其生香特性，并結(jié)合醋酸菌的醇酸轉(zhuǎn)化能力，考察單一或混合葡糖醋桿菌和酵母菌的發(fā)酵特征，為進一步開發(fā)酸甜醇協(xié)調(diào)匹配的柑橘發(fā)酵飲料提供理論指導(dǎo)和支持。

1 材料與方法

1.1 原料、菌株、培養(yǎng)基與試劑

柑橘：湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司提供的產(chǎn)自湖北省宜都市新鮮蜜柑。

葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter）TLH菌株：湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司；魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）菌株：功能酵母與釀造微生物實驗室從民間傳統(tǒng)釀造食品中分離純化獲得，其菌株保藏號為CCTCC M 2013310。

酵母種子制備培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：酵母粉 10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0，115 ℃滅菌 20 min。

醋酸菌種子制備培養(yǎng)基（luria－bertani medium，LB）：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～pH7.4，121 ℃滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：純柑橘濃縮液（還原糖濃度105.25 mg/mL，總糖濃度213.84 mg/mL），自然pH值，115℃滅菌15 min。

3，5－二硝基水楊酸 （3，5－dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）、葡萄糖（分析純）、胰蛋白胨（分析純）、蛋白胨（分析純）、無水乙醇（分析純）、蒽酮（分析純）、甲醇（色譜級）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母粉（優(yōu)級純）：安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉（分析純）：武漢市華順生物技術(shù)有限公司；硫酸（優(yōu)級純）：信陽市化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

CJ－1D超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；AMR612均質(zhì)機：中國安蜜爾電器實業(yè)有限公司；BL－75A高壓滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；PL2002電子天平：賽多利斯天平有限公司；WFJ 2000可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；CT15RE離心機：日本日立公司；SBA生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；ZHWY－2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。PURELAB Prima超純水儀：英國ELGA公司；7890B氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 柑橘濃縮汁的制備

新鮮宜昌蜜柑去皮后，將柑橘肉放入已用75%醫(yī)用酒精處理的榨汁機中破碎，再在10 000 r/min、10℃下離心10 min，收集上清。將柑橘肉汁液加熱至輕微沸騰，并適當攪拌，至液體體積減少至原體積的三分之一后，靜置冷卻至室溫。將柑橘濃縮汁于－20℃保存以備用。保存時間不超過1個月。

1.3.2 微生物的活化

分別將斜面保存的葡糖醋桿菌和魯氏酵母菌置于LB和YEPD培養(yǎng)基中，在200 r/min、30℃條件下振蕩培養(yǎng)18 h，以用于發(fā)酵。

1.3.3 發(fā)酵策略

依據(jù)接種的微生物種類、比例和設(shè)置的溶氧環(huán)境，共設(shè)置了12組發(fā)酵策略，如表1。

表1 本研究中使用的發(fā)酵策略Table 1 Fermentation strategies in this research

在已滅菌的柑橘肉汁培養(yǎng)基中，按照3%的總接種量加入已活化的葡糖醋桿菌或/和酵母菌。取1.5、0.5、1.0 mL葡糖醋桿菌或酵母菌種子活化液于已滅菌的2 mL離心管中，8 000 r/min、4℃條件下離心5 min，收集菌泥，并用等體積的已滅菌柑橘肉汁培養(yǎng)基重懸，再全部轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中。250 mL三角瓶裝50 mL柑橘肉汁培養(yǎng)基。所有策略下的發(fā)酵溫度均為30℃。取樣間隔時間由發(fā)酵初始（24 h內(nèi)）糖耗速率確定。發(fā)酵液樣品隨取隨測，如當時無法檢測，發(fā)酵樣品置于-20℃冰箱中保存，但不超過24 h。

1.3.4 參數(shù)檢測

取2 mL發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋適當倍數(shù)后，用于測定總糖、還原糖、乙醇和代謝產(chǎn)物。620 nm（總糖）或540 nm（還原糖）波長下的吸光值。

發(fā)酵樣品中的還原糖采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法檢測[5]。對應(yīng)的葡萄糖標準曲線的標準直線方程為y=321.99x+16.99（x為吸光值，y為糖濃度），R2值為0.999?？偺遣捎昧蛩彷焱y定[6]。對應(yīng)的總糖標準曲線方程為y=194.67x-9.987 8（x為吸光值，y為糖濃度），R2值為 0.990 9。

發(fā)酵樣品中的乙醇使用SBA生物分析傳感儀檢測[7]。

代謝產(chǎn)物采用帶有FID檢測器的安捷倫7890B氣相色譜儀檢測。色譜柱為HA-INNOWax毛細管柱（30 m×0.53 mm×1 μm）。在 0.1 mL發(fā)酵液上清中加入0.2 mL去離子水，再加入0.9 mL甲醇（色譜級），10 000 r/min、4℃離心10 min，取上清過0.22 μm濾膜。取 550 μL濾液，加入 400 μL 0.04%叔戊醇（內(nèi)標）和50 μL甲酸?；旌弦河糜跉庀嗌V分析。參數(shù)：分流比10∶1；流速5 mL/min；進樣口溫度250℃；檢測器溫度280℃。升溫程序：40℃保留5 min，以20℃/min升到120℃，再以min/10℃升到220℃，并保留3 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗設(shè)置3個平行。通過Excel計算平均值，并采用Origin 8.6軟件對發(fā)酵數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一微生物發(fā)酵過程

2.1.1 單一醋酸菌

醋酸菌被廣泛應(yīng)用于果醋等發(fā)酵過程中，是一類重要的食品微生物[8]。圖1顯示了葡糖醋桿菌TLH在柑橘濃縮汁中發(fā)酵時的總糖（圖1A）、還原糖（圖1B）和乙酸（圖1C）的變化過程。

圖1 接種葡糖醋桿菌TLH的柑橘濃縮汁的發(fā)酵過程Fig.1 The change of the total sugar，reducing sugar and acetate during fermentation period when Gluconacetobacter TLH was added in citrus juice concentrate

整體上，葡糖醋桿菌對糖的利用緩慢，無論是總糖還是還原糖，在發(fā)酵72小時后才開始被消耗。到發(fā)酵第120小時，總糖和還原糖的變化出現(xiàn)差異?？偺情_始持續(xù)積累，而還原糖則呈現(xiàn)消耗-積累-再消耗的模式。發(fā)酵結(jié)束時，3種控氧模式下的殘留還原糖差異不大，分布在77.41 mg/mL～88.07 mg/mL之間，但總糖濃度差異明顯。間歇振蕩模式下所積累的總糖最高，為496.22 mg/mL，而靜置發(fā)酵模式下的濃度為292.31 mg/mL。靜置模式和100 r/min振蕩模式具有相似的乙酸變化過程，均在發(fā)酵早期（24 h～48 h內(nèi)）減少，后緩慢積累，但從第120小時開始持續(xù)消耗，至第216小時消耗完。然而，在間歇振蕩模式下，乙酸在發(fā)酵前72小時被持續(xù)消耗完，但隨后的48 h大量積累，但最終依然會被消耗完全?？梢?，葡糖醋桿菌既利用了柑橘濃縮汁中的糖類物質(zhì)，也利用了乙酸，但也會殘留大量的糖，而且葡糖醋桿菌先利用糖再利用乙酸。

2.1.2 單一酵母菌

酵母是目前世界應(yīng)用最廣泛的一種微生物，釀造用酵母最大特點是能將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，是酒精類飲料和食品的重要成分[9]。當魯氏酵母添加到濃縮柑橘汁中后，3種發(fā)酵模式下的總糖（圖2A）、還原糖（圖2B）、乙醇（圖2C）和乙酸（圖2D）的變化過程圖2所示。

圖2 接種魯氏酵母CCTCC M 2013310的柑橘濃縮汁的發(fā)酵過程Fig.2 The change of the total sugar，reducing sugar，ethanol and acetate during fermentation period when Z.rouxii CCTCC M 2013310 was added in citrus juice concentrate

無論是何種溶氧水平，還原糖在發(fā)酵終點幾乎都被消耗完，且溶氧水平越高，還原糖消耗的越快。與還原糖不同，總糖主要在發(fā)酵第24小時～72小時期間被消耗，此后，總糖濃度變化緩慢，至發(fā)酵終點時總糖還有一些殘留。3種溶氧控制策略下，乙醇在發(fā)酵前120小時持續(xù)積累，最大積累濃度分別為65.00 g/L（168 h，靜置模式）、55.00 g/L（120 h，間歇振蕩模式）和 56.00 g/L（120 h，100 r/min振蕩模式），隨后被消耗。在發(fā)酵終點，乙醇濃度分別為21.00 g/L（靜置）、20.00 g/L（間歇振蕩）和15.00 g/L（100 r/min振蕩）。乙酸在不同的溶氧策略下顯示明顯的差異。靜置和持續(xù)振蕩模式下，柑桔濃縮汁中的乙酸在72 h內(nèi)消耗完全，但在隨后的發(fā)酵過程中，靜置模式下的乙酸會有一個積累－消耗的過程，而持續(xù)振蕩模式下的乙酸一直維持在0。間歇振蕩模式下，乙酸在發(fā)酵初期（0～24 h）就表現(xiàn)出一個消耗-積累的過程，隨后在第120小時被消耗完全，至發(fā)酵結(jié)束?？傮w上，魯氏酵母首先利用濃縮柑橘汁中的糖源生產(chǎn)乙醇，當糖源消耗到一定程度后，魯氏酵母重新利用乙醇。在發(fā)酵的前期和中期，乙酸與糖的利用具有一定的同步性。此外，不同的溶氧控制模式對魯氏酵母利用柑橘濃縮汁中總糖和還原糖以及代謝乙醇的影響并不大，但會明顯對乙酸的代謝產(chǎn)生影響。

2.2 混合微生物共酵過程

當把葡糖醋桿菌和魯氏酵母按照不同比例混合發(fā)酵柑橘濃縮汁后，發(fā)酵過程如圖3所示。

圖3 葡糖醋桿菌與魯氏酵母在柑橘濃縮汁中的共酵發(fā)酵過程Fig.3 The change of the total sugar，reducing sugar and ethanol during fermentation period when Gluconacetobacter TLH and Z.rouxii CCTCC M 2013310 was added in citrus juice concentrate

在2∶1（醋酸菌∶魯氏酵母）的接種比例條件下，柑橘濃縮汁中的總糖（圖3A）在3種溶氧控制模式下發(fā)酵24 h后均呈現(xiàn)下降過程，且持續(xù)振蕩模式下的總糖消耗更快，但在發(fā)酵結(jié)束時殘留濃度均在40 mg/mL左右。當增加魯氏酵母且同時降低葡糖醋桿菌的接種比例后，雖然3種溶氧控制模式下的總糖最終殘留濃度均在（35.00±3.00）mg/mL范圍，但是靜置模式和間歇振蕩模式的總糖變化過程與持續(xù)振蕩模式的差異更明顯。柑橘濃縮汁中的還原糖（圖3C和圖3D）也呈現(xiàn)出與總糖相似的變化趨勢，且在發(fā)酵結(jié)束前所有模式下的還原糖均被完全消耗?？傮w而言，間斷性改善溶氧對混合發(fā)酵的總糖和還原糖影響不大，而持續(xù)性供氧將顯著加快總糖和還原糖的代謝速度。

在這兩種接種量條件下，柑橘濃縮汁中的乙醇（圖3E和圖3F）變化均展現(xiàn)為發(fā)酵前期積累-中期短暫穩(wěn)定-后期消耗的過程。同時，在這兩種條件下均顯示出過高的溶氧水平并不利于一定程度乙醇在柑橘濃縮汁中的殘留。而且，增加魯氏酵母菌濃度后，發(fā)酵終點的乙醇最大濃度從間歇振蕩模式（圖3E，35.00 g/L）轉(zhuǎn)變?yōu)殪o置模式（圖3F，35.00 g/L）。這表明發(fā)酵終點的乙醇濃度受到酵母菌濃度和溶氧水平的雙重控制。在以葡糖醋桿菌為主體的柑橘濃縮汁中（圖3G），乙酸在發(fā)酵中期就被完全消耗，但在間歇振蕩模式下，乙酸在發(fā)酵后期還會出現(xiàn)積累過程，特別是在發(fā)酵結(jié)束的前24小時內(nèi)，而其它兩種溶氧控制模式下的乙酸濃度一直維持在零。當提高酵母的添加量而減少葡糖醋桿菌的濃度后（圖3H），柑橘濃縮汁中的乙酸被消耗的更快，3種溶氧水平下的乙酸濃度不超過72 h就變?yōu)榱?。但是，在靜置模式和間歇振蕩模式下，乙酸會重新積累并再被消耗。這個過程在靜置模式下持續(xù)48 h，而在間歇振蕩模式下持續(xù)72 h，最大積累濃度分別依次為 17.95 g/L（靜置，96 h）和 34.10 g/L（間歇振蕩，96 h）。

可見，接種量的變化和溶氧水平的差異不會對柑橘濃縮汁中的總糖和還原糖的最終殘留濃度產(chǎn)生影響，但明顯提升溶氧水平將加快糖的消耗。然而，糖耗速率的提升并沒有促進或抑制乙醇的積累，但接種量與溶氧的差異不會顯著改變乙醇的積累過程，但將影響乙醇的消耗過程和殘留乙醇的濃度。然而，這兩個控制條件既改變了乙酸的變化過程也影響了終濃度的高低。

2.3 不同發(fā)酵策略中乙偶姻

在代謝產(chǎn)物的檢測中，乙偶姻能夠被鑒定出來，它是一種重要的風(fēng)味物質(zhì)[10-11]。圖4展現(xiàn)了柑橘濃縮汁中乙偶姻在12種不同發(fā)酵策略下的變化過程。

圖4 乙偶姻在12種不同發(fā)酵策略下的變化過程Fig.4 The change of acetoin in twelve different fermentation strategies

在只接種葡糖醋桿菌的柑橘濃縮汁中，3種溶氧控制模式下的乙偶姻（圖4a）雖然在發(fā)酵早期呈現(xiàn)振蕩變化過程，但是在發(fā)酵后期只有少量的減少，且發(fā)酵終點時的濃度均不低于100 μg/mL。然而，只要加入魯氏酵母，無論是單獨接種還是與葡糖醋桿菌共發(fā)酵，柑橘濃縮汁中的乙偶姻均會被消耗殆盡。只存在單一的魯氏酵母時，乙偶姻在3種溶氧水平下以不同的速率被逐步利用（圖4b）。然而，在混合共酵模式下（圖4c和圖4d），乙偶姻表現(xiàn)出振蕩減少過程。此外，溶氧水平對乙偶姻的代謝也會產(chǎn)生影響，且這種影響還受到存在微生物的種類和接種比例的作用。

3 結(jié)論與討論

柑橘不僅是一種暢銷水果，也是發(fā)酵飲料的一種重要原料[12-15]。一般情況下，柑橘被榨汁以作為發(fā)酵原料，但其含糖量偏低，無法滿足微生物生長代謝的需求，往往還需要外加糖源以彌補碳源的不足[16]。本項目通過濃縮的方式提高柑橘汁的含糖量，在不加入任何外源營養(yǎng)物的情況下也能滿足醋酸菌和酵母菌生長的要求。

在柑橘濃縮汁中，葡糖醋桿菌只在發(fā)酵中期利用部分糖，在發(fā)酵后期反而積累大量的糖，但會將濃縮汁中的乙酸完全消耗完。酵母對柑橘濃縮汁中的糖只有消耗，但伴隨乙醇的積累，乙酸也會完全被消耗殆盡。溶氧水平的差異對醋酸菌和酵母菌在糖的消耗、乙醇的代謝沒有劇烈的影響，但是對乙酸的代謝產(chǎn)生作用。然而，將這兩種微生物混合共酵后，接種比例對總糖和還原糖影響不大，但持續(xù)提供溶氧將明顯加快柑橘汁中糖的下降速率。這兩個發(fā)酵控制因子對發(fā)酵后乙醇濃度和發(fā)酵中后期乙酸濃度產(chǎn)生不同的影響。溶氧水平對風(fēng)味物質(zhì)乙偶姻的代謝也會產(chǎn)生影響，且這種影響還受到存在微生物的種類和接種比例的作用。

上述研究結(jié)果表明，葡糖醋桿菌與魯氏酵母混合間歇振蕩模式發(fā)酵96 h，發(fā)酵的柑橘濃縮汁中的糖、醇、酸及其風(fēng)味物質(zhì)達到一定水平，其總糖和還原糖濃度分別為130.56 mg/mL和37.85 mg/mL，乙醇和乙酸濃度分別為56.00 g/L和33.97 μg/mL，乙偶姻濃度為34.02 μg/mL。發(fā)酵飲料是否成功的一個關(guān)鍵因素是口感是否舒適。這取決于飲料中酸甜醇的比例是否恰當。綜合上述研究結(jié)果可以看到，通過發(fā)酵調(diào)控技術(shù)實現(xiàn)酸甜醇協(xié)調(diào)柑橘飲料的制備需要在以下幾個方面進行控制：1）不能有過量的酵母菌，否則過于消耗糖源，也不利于柑橘濃縮汁中風(fēng)味物質(zhì)的保留；2）提高醋酸菌濃度，加快醇酸轉(zhuǎn)化速率；3）控制酵母菌生長速度，減緩糖耗速率；4）間歇性改善溶氧，有助于乙醇和乙酸的積累。發(fā)酵過程還需要結(jié)合口感評價和更詳細的風(fēng)味物質(zhì)分析以進一步的深入研究。