張繼旭， 張繼光， 孔凡玉， 申國明， 王 瑞， 高 林， 劉文濤，竇玉青， 毛新新， 王紅剛1，， 張忠鋒

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院，山東青島 266109； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101；3.云南省煙草公司昆明市公司，云南昆明 650011； 4.湖北省煙草公司恩施州分公司，湖北恩施 445000；5.臨沂市煙草公司，山東臨沂 276001)

四環(huán)素作為一類具有殺滅或抑制除放線菌外其他微生物作用的廣譜性抗生素，在世界范圍內(nèi)使用量巨大，尤其作為禽畜疾病預(yù)防藥物和生長促進劑而被大量用作飼料添加劑[1-2]，而未被機體吸收的部分原藥或尚有活性的代謝物隨畜禽糞便排出進入水體和土壤環(huán)境，造成四環(huán)素在環(huán)境中的殘留[3-6]。由于四環(huán)素類抗生素性質(zhì)相對穩(wěn)定并具有一定的持久性，目前在土壤、地表水、地下水中均檢測到了四環(huán)素殘留。Warman等在用雞糞施肥的土壤中發(fā)現(xiàn)，氯四環(huán)素的含量水平已經(jīng)接近其他農(nóng)藥類有機污染物的水平[7]。四環(huán)素類抗生素的環(huán)境行為、對土壤生態(tài)過程及其對作物種子萌發(fā)的影響目前受到廣泛關(guān)注[8-11]。

煙草作為我國重要的經(jīng)濟作物之一，在我國中南及西南地區(qū)廣泛種植，煙草在育苗栽培過程中通常大量施用有機類肥料，其中畜禽糞便類農(nóng)家肥及以此為原料制作的商品有機肥的施用，易導(dǎo)致土壤及水環(huán)境的抗生素殘留污染。近年來，關(guān)于四環(huán)素類抗生素對土壤呼吸、氮硝化及不同作物種子萌發(fā)影響的研究較多[8-11]，但四環(huán)素殘留對煙田土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及煙草幼苗毒性效應(yīng)的影響還鮮見報道。為此，本研究以典型的廣譜性抗生素——四環(huán)素為研究對象，采用微宇宙試驗，模擬不同濃度四環(huán)素添加后對煙田土壤碳氮礦化及煙草種子萌發(fā)的影響，以明確四環(huán)素殘留對煙田土壤生態(tài)過程及煙草種子萌發(fā)的生態(tài)毒理效應(yīng)，為后續(xù)畜禽糞便類有機肥施用的煙田環(huán)境風(fēng)險評估及合理應(yīng)用管理提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年在湖北省恩施州清江源現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)科技園區(qū)溫室中進行。供試土壤采自恩施州白果鄉(xiāng)茅壩槽煙田周邊的林地表層，土壤類型為黃棕壤，土樣采集后經(jīng)自然風(fēng)干，剔除根系等雜物，碾碎過2 mm篩后備用。其基本理化性質(zhì)為pH值6.9，有機質(zhì)含量19.23 g/kg，堿解氮含量 85.37 g/kg，有效磷含量62.70 g/kg，速效鉀含量 218.67 g/kg，未檢出四環(huán)素殘留。供試煙草品種為云煙87，來源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司。所用四環(huán)素鹽酸鹽(純度97.5%)來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 微宇宙試驗 將過2 mm篩的風(fēng)干土樣加入去離子水至最大田間持水量的40%，在25 ℃黑暗處預(yù)培養(yǎng)1周，以恢復(fù)土壤微生物活性，然后進行四環(huán)素礦化試驗。試驗設(shè)置1個對照和3個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的四環(huán)素添加處理，分別為CK(四環(huán)素添加量為0 mg/kg)、ST1(四環(huán)素添加量為 5 mg/kg)、ST2(四環(huán)素添加量為50 mg/kg)、ST3(四環(huán)素添加量為500 mg/kg)，每個處理重復(fù)3次。

土壤有機碳的礦化：稱取相當(dāng)于50 g干土的預(yù)培養(yǎng)土樣于150 mL塑料瓶中，加入相應(yīng)質(zhì)量的四環(huán)素，混勻，使土壤含水量達到最大田間持水量的60%，同時設(shè)不加土壤樣品的空白對照和不添加四環(huán)素的對照，放于1 L培養(yǎng)瓶中，同時在培養(yǎng)瓶中小心地放入1個內(nèi)裝10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液的50 mL三角瓶，以吸收土壤在培養(yǎng)期間釋放的CO2，并在培養(yǎng)瓶底部加入少量蒸餾水以保持土壤濕度，密封后置于28 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)1、3、7、14、21、27、42、56、84 d后取各處理的試驗樣品，定期測定土壤在培養(yǎng)期間CO2的釋放量。

土壤有機氮的礦化及硝化：稱取預(yù)培養(yǎng)的一定量土樣于150 mL塑料瓶中，加入不同質(zhì)量的四環(huán)素，混勻，并使土壤含水量達到最大田間持水量的60%，同時設(shè)不加四環(huán)素的對照，將各處理置于28 ℃恒溫恒濕箱內(nèi)培養(yǎng)，于土壤培養(yǎng)的1、3、7、14、21、27、42、56、84 d后取各處理的試驗樣品，測定土壤中硝態(tài)氮(NO3--N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。培養(yǎng)過程中每隔3 d用稱質(zhì)量法補充水分，以保持土壤濕度。

1.2.2 種子萌芽試驗 按GB/T 3543—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》進行。在直徑9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中放3層濾紙，加入不同濃度的5 mL四環(huán)素溶液，在水溶液中設(shè)置0、10、20、40、80、160 mg/L 6個濃度梯度，每個處理設(shè)50粒種子，共3個重復(fù)。置于28 ℃、4 000 lx的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行種子發(fā)芽與根伸長試驗。

1.2.3 土壤有機碳氮礦化的測定 添加四環(huán)素后土壤在培養(yǎng)期間的CO2釋放量采用BaCl2沉淀酸堿滴定法測定[12]；土壤中NO3--N和NH4+-N含量用2 mol/L KCl溶液浸提，吸取浸提液用分光光度法測定[13]；土壤氮礦化速率、硝化速率參照文獻[14-15]計算，公式如下：

礦化速率[mg/(kg·d)]=(Mt-M0)/Δt；

硝化速率[mg/(kg·d)]=(Nt-N0)/Δt。

式中：M0、Mt分別表示培養(yǎng)前、培養(yǎng)后無機態(tài)氮(NH4+-N+NO3--N)的含量，mg/kg；N0、Nt分別表示培養(yǎng)前、培養(yǎng)后硝態(tài)氮的含量，mg/kg；t表示培養(yǎng)時間，d。

1.2.4 種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和根伸長抑制率的測定 根據(jù)處理7、14 d時的種子發(fā)芽數(shù)分別計算發(fā)芽勢和發(fā)芽率。計算公式如下：

發(fā)芽勢=(7 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(培養(yǎng)結(jié)束時發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

根伸長抑制率=(對照組根長-處理組根長)/對照組根長×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果由SPSS 22.0進行模型擬合，計算出四環(huán)素的根伸長10%抑制濃度(IC10)和50%抑制濃度(IC50)；采用Excel 2007對所有試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素對土壤有機碳礦化速率和累積礦化量的影響

從圖1可以看出，在培養(yǎng)的第1天，各處理土壤有機碳的礦化速率依次為ST3>ST1>ST2>CK。各處理的礦化速率隨培養(yǎng)時間延長迅速上升，到培養(yǎng)7 d時達到最大值，具體表現(xiàn)為ST1>ST3>ST2>CK，此時四環(huán)素各處理的有機碳礦化速率均高于CK，隨后開始下降。培養(yǎng)14 d后各處理與CK的差異不斷減小，至84 d后培養(yǎng)結(jié)束時，各處理土壤的有機碳礦化速率與對照無明顯差異。不同處理的土壤有機碳累積礦化量在培養(yǎng)前期(前14 d)增加較快，隨后變緩并持續(xù)增加至培養(yǎng)結(jié)束。在整個培養(yǎng)過程中，ST1、ST2處理的有機碳累積礦化量與CK相比無明顯差異，僅在培養(yǎng)第28天之后，ST3處理的累積礦化量才明顯高于CK處理，至培養(yǎng)結(jié)束時比CK增加13.75%?？梢?，中低量四環(huán)素添加(50、5 mg/kg)對土壤有機碳礦化無明顯影響，而較高量(500 mg/kg)的四環(huán)素則在一定程度上促進有機碳礦化，特別在培養(yǎng)后期表現(xiàn)出累積礦化量的增加。

2.2 四環(huán)素對土壤氮礦化速率及硝化速率的影響

從圖2可以看出， 添加四環(huán)素后均不同程度地促進了土壤氮素的轉(zhuǎn)化。其中各處理土壤的有機氮礦化速率變化趨勢基本一致，隨培養(yǎng)時間延長大致呈“W”形波動。在培養(yǎng)前期(前 7 d)，各處理的氮素礦化速率均為負值，且不同處理土壤的有機態(tài)氮礦化速率差異較大，但處理間的差異隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷減小，至培養(yǎng)結(jié)束時，添加四環(huán)素各處理的氮礦化速率與CK無明顯差異。在整個培養(yǎng)過程中，各處理土壤氮的硝化速率變化均隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)先增加后降低再趨于穩(wěn)定的趨勢。四環(huán)素處理的土壤氮素硝化速率整體上高于CK，后期則與CK處理基本一致。結(jié)果顯示，四環(huán)素添加能在一定程度上刺激土壤氮素的礦化及硝化作用，并隨著培養(yǎng)時間延長其激發(fā)作用不斷減弱。

2.3 四環(huán)素對煙草種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，隨著四環(huán)素溶液濃度的增大，煙草種子的發(fā)芽勢與發(fā)芽率總體上均呈下降趨勢。但當(dāng)四環(huán)素溶液濃度較低時(≤40 mg/L)，其對煙草種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率的影響與對照(0 mg/L)相比差異均不顯著；當(dāng)四環(huán)素濃度達到 160 mg/L 時，煙草種子的發(fā)芽勢與對照相比差異顯著(P<0.05)，且比對照降低12.5百分點。對于發(fā)芽率來說，四環(huán)素濃度為80、160 mg/L時與對照差異顯著，且分別比對照下降15.2、25.7百分點。因此，較低濃度的四環(huán)素溶液(40 mg/L)對煙草種子發(fā)芽沒有明顯影響，但隨著濃度升高，煙草種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率受影響的程度隨之增加，表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表1 四環(huán)素對煙草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 四環(huán)素對煙草根伸長及根伸長抑制率的影響

從圖3可以看出，本試驗范圍內(nèi)的5種不同濃度的四環(huán)素均對煙草根長具有不同程度的抑制效應(yīng)。隨著四環(huán)素濃度的增加，根長呈逐漸下降的趨勢，根伸長抑制率呈逐漸上升的趨勢。在不添加四環(huán)素的對照中，煙草的根長為5.70 cm，當(dāng)四環(huán)素濃度為10 mg/L時，根長與對照處理差異不顯著；當(dāng)四環(huán)素濃度為20 mg/L時，與對照處理的根長差異顯著；當(dāng)四環(huán)素濃度為160 mg/L時，煙草的根長僅為2.48 cm，根伸長抑制率為56.49%。

當(dāng)前經(jīng)常采用植物的IC50來評價污染物的生態(tài)毒性強弱[16-17]，但當(dāng)環(huán)境中污染物的濃度達到IC50時，表明植物已經(jīng)受到嚴(yán)重影響，所以IC10通常被認為是引起植物受害的毒性閾值[11]。由表2可以看出，在水溶液中，煙草根伸長抑制率與四環(huán)素濃度呈對數(shù)正相關(guān)，且相關(guān)性顯著(P<0.05)，隨著四環(huán)素濃度升高，根長隨之減少而根長抑制率呈對數(shù)增加，而且四環(huán)素對根伸長抑制率的IC10、IC50分別為6.65、110.20 mg/L，即煙草根伸長被抑制50%時的四環(huán)素濃度為 110.20 mg/L，四環(huán)素濃度對煙草根伸長抑制率具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 煙草的根伸長與四環(huán)素的抑制率方程及其敏感性

注：介質(zhì)為水溶液。

3 討論與結(jié)論

土壤有機碳礦化(微生物呼吸)和氮轉(zhuǎn)化能力是衡量土壤微生物活性的重要指標(biāo)，二者的動態(tài)變化直接反映了土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的變化[18]。四環(huán)素添加通過殺滅或抑制土壤中的某些微生物類群，從而影響土壤的微生物群落及造成其一系列生態(tài)功能的改變，如土壤有機質(zhì)分解、氮轉(zhuǎn)化及酶活性等[19]。從研究結(jié)果來看，四環(huán)素各處理的有機碳礦化速率均不同程度地高于CK，但到培養(yǎng)結(jié)束時，各處理與對照間無明顯差異，其原因一方面可能是在培養(yǎng)后期，隨著添加的四環(huán)素不斷降解，其濃度下降至不能對土壤碳礦化產(chǎn)生明顯影響的水平；另一方面，受四環(huán)素脅迫影響，土壤微生物群落發(fā)生選擇性改變，并迅速恢復(fù)到原來的群落功能，從而使土壤呼吸(碳礦化)速率得以恢復(fù)[20]。中低量四環(huán)素添加(50、5 mg/kg)對土壤有機碳礦化無明顯影響，而高量(500 mg/kg)的四環(huán)素則在一定程度上促進有機碳礦化，特別在培養(yǎng)后期表現(xiàn)出累積礦化量的明顯增加?？傮w來看，添加四環(huán)素各處理的土壤有機碳累積礦化量略高于CK，且在試驗濃度范圍內(nèi)隨四環(huán)素添加量的增加而升高。這也說明添加四環(huán)素會在一定程度上刺激土壤有機碳的礦化，其原因可能是四環(huán)素作為含碳豐富的物質(zhì)，會被土壤中某些抗性微生物作為碳源利用，促進了微生物的生長繁殖，從而提高了土壤的呼吸作用[21]；而且抗生素的“非靶標(biāo)微生物”耐受性和活性增強也會使土壤呼吸作用得以促進[22]。但也有研究認為，施用抗生素后能殺死土壤中某些微生物，會使土壤呼吸作用受到抑制[23-24]，或者在試驗條件下添加抗生素并沒有對土壤呼吸產(chǎn)生影響[25]。這種差異的產(chǎn)生可能與復(fù)雜的土壤理化性質(zhì)、不同的微生物群落組成及其對外界脅迫的耐受程度有關(guān)。

四環(huán)素對土壤氮素礦化和硝化的影響具有時間依賴型，在培養(yǎng)前期均不同程度提高了土壤氮素的礦化速率及硝化速率，在培養(yǎng)后期的影響則不斷減弱，這對土壤中硝酸鹽的積累及其氮素損失具有一定風(fēng)險。各處理土壤有機氮的礦化速率在培養(yǎng)前期(前7 d)出現(xiàn)負值，說明初始土壤的氮轉(zhuǎn)化主要表現(xiàn)為硝化作用，大量的銨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化，這可以從四環(huán)素對土壤硝化作用的結(jié)果看出。有研究表明，四環(huán)素類抗生素能顯著增加土壤中的銨根離子含量，在一定程度促進土壤的氮礦化，其原因可能與土壤中真菌類微生物的增加從而促進了相關(guān)酶的活性有關(guān)[26]。本研究中各處理土壤硝化速率呈現(xiàn)先增大后減小再緩慢增加至穩(wěn)定的趨勢，特別在培養(yǎng)前期(前28 d)，四環(huán)素添加各處理的土壤氮素硝化速率明顯高于對照，表明添加四環(huán)素能在一定程度上刺激土壤的硝化作用，這對煙田土壤中硝態(tài)氮的淋失及反硝化作用造成的氮素損失具有一定風(fēng)險。目前關(guān)于四環(huán)素對土壤硝化作用影響的研究所得結(jié)論并不一致，楊基峰等的研究表明，氧四環(huán)素在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對硝態(tài)氮含量影響不顯著，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下存在顯著影響，并對土壤的硝化作用產(chǎn)生一定抑制作用，但在不同土壤類型中存在一定差異[9]；有研究認為氧四環(huán)素可能通過抑制土壤硝化微生物的活性而降低土壤的硝化作用[27]；也有研究認為 0～250 mg/L氧四環(huán)素對污泥中的氮素硝化過程無明顯影響[28]。因此，關(guān)于四環(huán)素對土壤氮轉(zhuǎn)化過程的影響并沒有一致結(jié)論，后面還需要從土壤性質(zhì)、抗生素濃度、溫濕度、氨氮含量及氮轉(zhuǎn)化微生物等諸多角度進行系統(tǒng)研究與闡述。

四環(huán)素殘留一方面會通過影響土壤碳氮轉(zhuǎn)化功能而間接影響作物養(yǎng)分吸收及生長，另一方面也會以直接的毒性效應(yīng)對作物生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響[29]。當(dāng)在土壤或水體中添加土霉素時，白菜種子發(fā)芽率總體呈下降趨勢，而當(dāng)添加金霉素時，其對白菜種子發(fā)芽沒有顯著的生態(tài)毒性效應(yīng)[30]。肖明月等以小白菜為受試生物的研究表明，在0.5～5.0 mg/L抗生素脅迫下，小白菜種子的發(fā)芽率無顯著變化，隨著抗生素暴露濃度的增加，小白菜種子的發(fā)芽率受到了顯著抑制，抗生素暴露濃度與小白菜根伸長抑制率之間具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系[10]。安婧等的研究認為，土霉素對小麥種子出芽沒有產(chǎn)生顯著的影響[31]，這可能是由于種皮對土霉素溶液也具有一定的吸附功能，它在胚芽與污染環(huán)境中間架起了一道“保護屏障”，使種子正常發(fā)芽[32]。而四環(huán)素類抗生素對不同作物毒性效應(yīng)的研究結(jié)果并不一致，其影響可能取決于測試環(huán)境、受試植物類型及抗生素濃度等多種因素[7，30，33]。本研究結(jié)果顯示，低濃度四環(huán)素溶液(40 mg/L)對煙草種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率無顯著影響，隨著濃度升高，煙草種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率受影響程度隨之增加。當(dāng)四環(huán)素濃度為160 mg/L時顯著降低了煙草種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率。

與發(fā)芽率相比，根生長受四環(huán)素的影響更敏感。四環(huán)素對根伸長抑制率的IC10、IC50分別為6.65、110.20 mg/L，四環(huán)素溶液濃度與煙草種子根伸長及根伸長抑制率均具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。種子根部作為養(yǎng)分吸收器官，更容易感受到外源污染物的刺激或脅迫，作物根長被認為是對抗生素更為敏感的生態(tài)毒理指標(biāo)[33-34]。這可能是由于植物對環(huán)境中抗生素的吸收主要通過根系，吸收的抗生素大部分被蓄積在根部，只有少量被轉(zhuǎn)運至地上部[34-37]；Chen等的研究也認為，有機化合物在相同濃度下對小麥幼苗根長的抑制效應(yīng)大于其他參數(shù)[38]。因此，根伸長抑制率可作為診斷抗生素對土壤及作物生態(tài)毒性的敏感性指標(biāo)，及時反映土壤被四環(huán)素類抗生素污染的狀況。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在添加5～10 mg/L氧四環(huán)素的水培試驗中，不同作物的根系生長受到抑制作用，但在相同條件下的土培試驗中卻沒有抑制作用[39]。四環(huán)素在土培試驗中比在水培試驗中有更弱的抑制作用，一方面是因為土壤自身具有較強的緩沖性能和吸附能力[40-42]，另一方面可能是因為四環(huán)素類藥物易與二價金屬離子形成螯合物，從而降低了其在土壤中的有效含量[43-44]。但要進一步明確四環(huán)素對煙草生長發(fā)育的毒性效應(yīng)及其機制，尚需要不同環(huán)境下的模擬試驗及對煙草生理生化過程的系統(tǒng)深入研究。