關(guān) 玲， 趙密珍， 王慶蓮， 吳偉民， 錢亞明， 巫建華

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014；2.江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇句容 212400)

果樹作為重要的園藝作物，在國民生產(chǎn)中占有重要地位。分子生物學(xué)研究作為有效的試驗(yàn)工具，被廣泛應(yīng)用于果樹研究中[1-3]。同時(shí)，隨著果樹基因組數(shù)據(jù)的逐漸豐富，越來越多的果樹物種基因組信息得到了注釋，因此，開展果樹分子生物學(xué)研究，對于挖掘功能基因以及通過基因工程等手段實(shí)現(xiàn)為果樹育種服務(wù)的目標(biāo)被越來越多的果樹育種工作者接受[4-6]。

RNA的提取作為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)步驟，其成熟度較為重要。果樹作為多年生木本或草本植物，因其多年生的特點(diǎn)，多富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，使其RNA的提取及純化工作較為困難[7]。生物試劑盒對于分子生物學(xué)研究具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，但當(dāng)今市場上尚沒有針對果樹物種RNA提取的試劑盒，并且利用廣譜的植物RNA提取試劑盒提取果樹物種RNA具有不穩(wěn)定的特點(diǎn)。常用的傳統(tǒng)RNA提取方法有TRIzol方法、苯酚法、氯化鋰沉淀法、異硫氰酸胍法及十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)/酚抽提方法[8-11]，以上方法具有價(jià)格昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的特點(diǎn)，且得到的果樹RNA產(chǎn)量較少[12]。此外，筆者通過試驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，TRIzol方法多適用于草本植物，不適用于木本植物材料的RNA提取。本試驗(yàn)通過對十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)法的進(jìn)一步改良，得到通用于提取果樹不同代表物種如草莓(草本)、蘋果(木本)以及葡萄(藤本)不同組織RNA的方法。本研究以期通過對比不同RNA提取方法和進(jìn)一步改進(jìn)已有的CTAB提取方法，為果樹分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)、準(zhǔn)確的RNA提取方法，從而方便果樹研究者進(jìn)行后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料草莓、葡萄均取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)田，草莓(Fragaria×ananassaDuch.)品種為寧玉[13]，定植時(shí)期為2014年9月初；葡萄(VitisL.)的組培苗、大田苗品種皆為紅寶石無核，其中組培苗為胚挽救后代種苗，大田苗為5年生植株；蘋果材料采自山東省臨沂市平邑縣一年生蘋果(Malusdomestica)砧木M9。用于RNA提取的草莓、蘋果和葡萄的組培苗材料均采集根、莖、葉(圖1-A、圖1-B、圖1-C)3種組織；于葡萄大田苗上采集根、莖、葉、果皮和果肉(圖1-D)5種組織，所采集的樣品應(yīng)盡量呈幼嫩狀態(tài)并立即置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于-70 ℃冰箱中待用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 改進(jìn)后的CTAB裂解液母液的配制成分 (1)5 mol/L NaCl(使用濃度為1.4 mol/L)。(2)0.5 mol/L EDTA·2Na(pH值為8.0，使用濃度為20 mmol/L)。用磁力攪拌器劇烈攪拌，加入NaOH調(diào)節(jié)pH值到8.0時(shí)，EDTA·2Na方可溶解。(3)1 mol/L Tris-HCl(pH值為8.0，使用濃度為 0.1 mol/L)，用HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0。(4)2%(質(zhì)量濃度)CTAB。(5)2%(質(zhì)量濃度)聚乙烯吡咯烷酮K-30(polyvinylpyrrolidone K-30，簡稱PVP K-30)。以100 mL為例，用適量體積的上述各組分母液配制CTAB裂解液：28 mL NaCl，4 mL EDTA·2Na，1 mL Tris-HCl，2 g CTAB，2 g PVP，用RNase free ddH2O定容。

1.2.2 其他組分及試劑 (1)10 mol/L LiCl(LiCl易吸潮，需快速操作，注意溶解放熱燙)；(2)3 mol/L NaAc(pH值5.2)；(3)β-巰基乙醇，使用濃度為1%；(4)70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇；(5)三氯甲烷+異戊醇(體積比24 ∶1)；(6)水飽和酚(pH值4.5)；(7)無水乙醇；(8)ddH2O(RNase free)。

配制各組分試劑均使用ddH2O，配制完畢后加入外源RNA酶清除劑處理24 h后待用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果樹RNA提取的操作步驟 (1)取待提取RNA試材(除果實(shí)外的組織取材質(zhì)量約為0.5～1.0 g，果實(shí)質(zhì)量為 1.5～2.0 g)，置于液氮中迅速研磨成粉末，將1 000 μL CTAB裂解液和20 μLβ-巰基乙醇依次加入2 mL離心管中，于 65 ℃ 水浴30 min(水浴過程中每隔10 min將離心管上下顛倒約30次，以保證待提取試材與CTAB裂解液充分接觸)；(2)加入等體積的三氯甲烷+異戊醇(體積比24 ∶1)，旋渦混勻，8 000g、4 ℃離心10 min；(3)取800 μL上清，加入1/2體積的水飽和酚(pH值4.5)，混勻，靜置5 min，再加入1/2體積的三氯甲烷+異戊醇(體積比24 ∶1)，旋渦混勻；8 000g、4 ℃ 離心10 min；(4)取600 μL上清(在1.5 mL離心管中操作)，加入1/30體積的NaAc(3 mol/L，pH值5.2)和1/10體積的無水乙醇，混勻后靜置5 min，8 000g、4 ℃離心10 min；(5)取450 μL上清，加入1/3體積的LiCl(10 mol/L)，-20 ℃ 靜置2～3 h；8 000g、4 ℃離心15 min；(6)棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，再用無水乙醇洗滌沉淀1次，室溫干燥，將清洗后的沉淀溶于ddH2O(RNase free)中，于-70 ℃保存?zhèn)溆茫?7)取2 μL總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(電泳儀電壓不宜設(shè)置過大，否則會因產(chǎn)熱引起RNA樣品降解導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確)；(8)將RNA樣品上Biophotometer核酸儀檢測，體系為1 μL RNA樣品加入49 μL ddH2O(RNase free)，RNA濃度、D280 nm/D260 nm值和D260 nm/D230 nm值直接從儀器上讀取。

1.3.2 基因組DNA的消化及反轉(zhuǎn)錄 利用上述方法提取的RNA樣品中，存在少許基因組DNA，其消化及cDNA的合成按照TaKaRa公司的PrimerScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa，貨號：RR047A)說明書進(jìn)行。為確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，消化及反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)需在冰上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA瓊脂糖電泳檢測

RNA產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖2結(jié)果顯示，經(jīng)過改進(jìn)的CTAB法提取多年生草本、木本及藤本果樹材料均可獲得清晰的3條RNA條帶，如圖2分別是28.0S rRNA、18.0S rRNA、5.8S rRNA及少量gDNA(基因組DNA)。凝膠結(jié)果顯示點(diǎn)樣孔清晰、無污染。

2.2 RNA純度檢測

利用Biophotometer核酸儀對所提取樣品RNA的吸光度及產(chǎn)量進(jìn)行檢測。 結(jié)果表明， RNA樣品的D260 nm/D230 nm值均高于2.0，具體為2.03～2.27(表1)。說明利用改進(jìn)后的CTAB法抽提獲得的RNA所含多糖、酚類及其他小分子物質(zhì)較少。草莓、蘋果大田苗及葡萄組培苗的根、莖、葉片RNA的D260 nm/D280 nm值范圍為1.80～1.93，葡萄大田苗各組織RNA的D260 nm/D280 nm值為1.80～1.91，表明利用本方法抽提獲得的果樹RNA中雜質(zhì)蛋白質(zhì)污染較少。不同組織的RNA產(chǎn)量情況如下：根器官RNA產(chǎn)量為600.15～712.75 ng/μL；莖RNA產(chǎn)量為530.61～694.54 ng/μL；葉片RNA產(chǎn)量為617.54～777.53 ng/μL；果皮RNA產(chǎn)量為561.23 ng/μL；果肉RNA產(chǎn)量為40.23 ng/μL。

表1 分光光度法檢測RNA質(zhì)量及產(chǎn)量

注：吸光度比值為3個(gè)樣品重復(fù)的平均值。

綜合上述4種試材不同組織的D260 nm/D230 nm值及所得RNA產(chǎn)量情況，可以得出草莓、蘋果以及葡萄RNA的提取在根、莖、葉3種營養(yǎng)器官中出現(xiàn)一致的難易度趨勢，即葉片較根容易提取，兩者皆較莖容易提取得到RNA；葡萄大田苗生殖器官的RNA提取難易程度表現(xiàn)為果皮較果肉容易。

2.3 RNA提取后的質(zhì)量檢測

為檢測RNA質(zhì)量是否滿足RT-PCR試驗(yàn)，設(shè)計(jì)草莓的內(nèi)參基因FvMSI1的引物如下：F，5′-TCCCCACACCTTTGATT GCCA-3′；R，5′-ACACCATCAGTCTCCTGCCAAG-3′。蘋果內(nèi)參基因18S rRNA引物如下：F，5′-GTTACTTTTAGGACT CCGC C-3′；R，5′-TTCCTTTAAGTTTCAGCCTTG-3′。葡萄內(nèi)參基因?yàn)閁BI，F(xiàn)：5′-GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC-3′；R：5′-AACATAGGTGAGGCCGCACTT-3′。使用所提取的果樹RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用上述引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(圖3)，分析結(jié)果可知，利用該方法獲得的RNA均可用于后續(xù)的RT-PCR試驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

3.1 RNA提取前的準(zhǔn)備工作

RNA提取的關(guān)鍵是抑制細(xì)胞中的RNA分解和防止操作環(huán)境中的RNA酶污染。因此在試驗(yàn)中應(yīng)采取以下措施：(1)使用70%乙醇清潔試驗(yàn)操作臺；(2)使用RNA操作專用試驗(yàn)臺，或者利用外源RNA酶清除劑處理臺面及操作用到的所有器具(研缽、鑷子、藥匙等)；(3)水浴鍋提前預(yù)熱、離心機(jī)提前預(yù)冷。通過上述方法主要防止外界環(huán)境、空氣或者試驗(yàn)者唾液中RNA酶的污染。

3.2 改良CTAB法的優(yōu)點(diǎn)

3.2.1 提取液改進(jìn)PVP用量 本試驗(yàn)在RNA的提取過程中改進(jìn)了PVP的用量，不僅能去除果樹各組織中的酚類物質(zhì)和多糖，還能去除一些其他色素和脂類物質(zhì)，同時(shí)可以消除泡沫，保護(hù)膠體，可以提取得到更完整和純度更高的RNA產(chǎn)物。同時(shí)與傳統(tǒng)的CTAB法相比[12，14]，本方法改進(jìn)了各組分的用量，如CTAB提取液的用量(1 mL)、β-巰基乙醇的使用濃度(1%，體積分?jǐn)?shù))和NaAc濃度(3 mol/L)，一方面可以節(jié)約成本，另一方面可以減少如β-巰基乙醇等物質(zhì)在操作過程中的毒害作用。進(jìn)一步分析可知，所提取的RNA與傳統(tǒng)方法相比，擁有高純度(D260nm/D230 nm值>2.0，D260 nm/D280 nm值>1.8)的特點(diǎn)，同時(shí)RNA產(chǎn)量較高(除果肉RNA產(chǎn)量為 40.23 ng/μL 外，其余材料的產(chǎn)量范圍為530.61～777.53 ng/μL)，其質(zhì)量及產(chǎn)量均滿足后續(xù)的RT-PCR試驗(yàn)要求。

3.2.2 高效穩(wěn)定 相對于生物公司銷售的成品RNA提取試劑盒，本方法具有操作簡便、試驗(yàn)結(jié)果可靠性高及節(jié)本的特點(diǎn)。筆者所在課題組曾嘗試使用多種成品試劑盒提取果樹不同組織中的RNA，發(fā)現(xiàn)效果均不理想。尤其是提取木質(zhì)化程度較高的果樹材料及次生代謝物質(zhì)含量較高的果樹生殖器官RNA，如葡萄的果皮和果肉組織。分析其原因可能是在成品試劑盒中，針對木本果樹特有的多酚、多糖的去除技術(shù)尚未成熟。同時(shí)考慮到果樹物種的季節(jié)性較強(qiáng)，樣品采集的重復(fù)性較差，應(yīng)用高效穩(wěn)定的RNA提取方法對于果樹分子生物學(xué)研究十分重要。筆者通過多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)本研究改進(jìn)的CTAB法具有重復(fù)性好、可靠性高的特點(diǎn)，尤其適用于木本果樹的RNA提取。本研究分別選取草本、木本及藤本果樹的不同營養(yǎng)器官及生殖器官開展研究，進(jìn)一步驗(yàn)證了改進(jìn)后的CTAB法可用于不同類型果樹各組織RNA的提取，從而為果樹分子生物學(xué)研究提供了高效穩(wěn)定的RNA提取方法。

3.2.3 CTAB法與TRIzol方法的比較 筆者曾利用靈敏且快捷的TRIzol方法對蘋果材料不同組織的RNA進(jìn)行提取，結(jié)果均不理想(只有幼嫩的葉片材料可獲得少量的RNA，其他木質(zhì)化程度較高的材料均無法獲得RNA)。利用TRIzol方法提取擬南芥以及果樹研究中的果實(shí)模式植物——番茄卻可以得到理想結(jié)果(圖4)，但成品TRIzol試劑價(jià)格昂貴。筆者分析其原因，可能是木本果樹中的多酚等次生代謝物質(zhì)阻礙了TRIzol試劑對果樹組織內(nèi)RNA的分離，但是應(yīng)用TRIzol方法提取其他草本植物RNA仍不失為一種優(yōu)良方法?；诖?，筆者提出，本研究中改進(jìn)的CTAB法適用于木本果樹材料，同時(shí)對于珍稀材料或者采集重復(fù)性較差的試驗(yàn)樣品使用該方法可提高穩(wěn)定性，減少材料損失。

3.2.4 外源RNA酶清除劑替代焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，簡稱DEPC)處理 利用上述外源RNA酶清除劑可以較快速地去除所用試劑、器具及RNA提取環(huán)境中的RNA酶，與傳統(tǒng)的DEPC處理方法[15]相比，可以省去繁瑣的高溫滅菌步驟，且外源RNA酶清除劑的使用，具有快速、操作簡便及無毒的特點(diǎn)。

3.3 果樹RNA提取過程中可能出現(xiàn)的問題及對策

3.3.1 瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔模糊或D260 nm/D230 nm值非正常范圍 正常提取所得RNA的D260 nm/D230 nm值≥2，若該值偏小或瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔模糊，說明所提取的RNA樣品中有雜質(zhì)多糖、多酚或其他鹽類小分子物質(zhì)。本試驗(yàn)材料的D260 nm/D230 nm值范圍為2.03～2.27?？梢娎迷摲椒ㄔ谔崛∫褐屑尤胼^高質(zhì)量濃度的PVP，能夠有效地去除果樹組織中的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì)，同時(shí)提高RNA的完整性和純度。

3.3.2 提取樣品RNA呈現(xiàn)褐色 本研究提取的試材不新鮮，存在褐化，或由于研磨過程中未能保持樣品處于液氮中，抑或由于研磨所得的樣品在裝入離心管之前未在管中及時(shí)添加β-巰基乙醇，導(dǎo)致研磨樣品與空氣中的氧氣接觸，從而使試材中的酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)而呈現(xiàn)褐色。解決對策有以下2個(gè)：一是保證提取試材新鮮并處于超低溫環(huán)境；二是保證研磨所得樣品在裝入離心管前加入β-巰基乙醇，以防止樣品褐化。此外，整個(gè)研磨及裝管過程需要操作迅速。

3.3.3D260 nm/D280 nm值及產(chǎn)量D260 nm/D280 nm值正常范圍為1.8～2.0，其值偏小說明RNA樣品中有雜質(zhì)蛋白質(zhì)污染；其值偏大說明RNA降解嚴(yán)重。苯酚在低pH值的情況下可促進(jìn)水相中的蛋白質(zhì)和DNA向有機(jī)相分配，從而最大限度地去除總RNA中的蛋白質(zhì)和DNA，因此在抽提過程中需要加入水飽和酚(pH值4.5)。本試驗(yàn)中葡萄大田苗生殖器官的RNA提取難易程度為果肉遠(yuǎn)難于果皮，分析其原因，可能是果肉中的水分含量較高。操作者在研磨時(shí)為降低雜質(zhì)出現(xiàn)的概率，會加入較少量的葡萄果肉材料，導(dǎo)致最終RNA產(chǎn)量較少。因此，對于葡萄果實(shí)的提取，可以適當(dāng)增加試材的研磨量(1.5～2.0 g)，以提高果實(shí)的RNA產(chǎn)量，從而滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

3.3.4 LiCl選擇性地沉淀RNA 利用該法可以充分去除RNA中的DNA污染。若樣品量允許，可以進(jìn)行2次LiCl沉淀。注意使用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇至少洗滌2次，避免RNA中因含有LiCl(金屬Li+)而影響反轉(zhuǎn)錄的效果。本研究通過反復(fù)試驗(yàn)，比較經(jīng)典草本植物RNA提取的TRIzol方法以及改進(jìn)的CTAB方法，摸索出更加成熟的可通用于草本、木本果樹不同組織RNA提取的新方法，經(jīng)檢測，所提取得到的RNA可以直接用于后續(xù)研究。