劉佩，于文江，鄭紅

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250103）

食用色素能夠改善食品色澤，是食品添加劑的一個(gè)重要組成部分，在食品加工業(yè)中具有十分重要的地位。按其來(lái)源和性質(zhì)，食用色素分為天然色素和合成色素，天然色素安全對(duì)環(huán)境無(wú)污染[1]，但穩(wěn)定性較差。合成色素價(jià)格便宜、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好，目前在食品加工方面應(yīng)用廣泛，但是合成色素大多屬于偶氮類化合物，對(duì)人體健康存在一定的不安全性。我國(guó)允許在食品中添加的合成色素有莧菜紅、胭脂紅、檸檬黃、新紅、赤蘚紅、日落黃、亮藍(lán)、酸性紅、喹啉黃、靛藍(lán)及其鋁色淀。而根據(jù)我國(guó)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]規(guī)定，它們禁止用于新鮮水果。

目前，食品中人工合成色素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[3-7]、紫外分光光度法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8,9]、毛細(xì)管電泳法[10]、極譜法[11]和薄層色譜法等。由于水果本身含有大量的天然色素，建立一種針對(duì)水果中多種人工合成色素同時(shí)檢測(cè)的方法是十分必要的。文章對(duì)水果中易添加的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅7種人工合成色素的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，建立了同時(shí)檢測(cè)水果中違規(guī)添加的7種人工合成色素的高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅（純度>99.5%），國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。甲醇（色譜純），德國(guó)Merck公司。醋酸銨（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)。Waters 2695高效液相色譜儀，包括在線真空脫氣機(jī)、四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司；MS204S電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海和羽良電子科技有限公司；Milli-Q IQ7000型超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；SB-800 DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎過(guò)的新鮮水果樣品5g至25mL比色管中，加入20mmol/L醋酸銨水溶液15mL，超聲提取15min，用20mmol/L醋酸銨水溶液定容至刻度，混合搖勻，經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅各50.0mg，加超純水溶解并定容至50mL，此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.0mg/mL。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，配制成 5、10、20、40、80、100μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 色譜條件

流動(dòng)相：A-20mmol/L醋酸銨溶液，B-甲醇。流速：0.8mL/min。色譜柱：C18（3.5μm，4.6mm×150mm），柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，進(jìn)樣量：10μL，梯度洗脫。

1.2.4 定性定量測(cè)定

將經(jīng)過(guò)前處理的水果樣品，進(jìn)樣經(jīng)HPLC分析。采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和目標(biāo)物光譜圖對(duì)樣品峰進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算定量。濃度的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅使用7種合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中各種色素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相選擇及優(yōu)化

目前高效液相色譜檢測(cè)流動(dòng)相主要是甲醇和乙腈，試驗(yàn)分別考察了甲醇-甲酸銨、乙腈-甲酸銨、甲醇-醋酸銨、乙腈-醋酸銨4種流動(dòng)相體系對(duì)7種色素的分離效果。綜合考慮分離度、樣品的分析時(shí)間和目標(biāo)組分峰形，選用甲醇-醋酸銨為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。分離后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for mobile phase

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard substance

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化好的試驗(yàn)條件下，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以基線噪聲10倍峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限見(jiàn)表2。由表2可以看出，在0～100μg/mL的濃度范圍內(nèi)，7種合成色素的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表2 7種合成色素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Linear range,regression equation,correlation coefficient and quantitative limit of 7 synthetic pigments

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取一空白水果樣品加標(biāo)（0.10mg/kg），重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算出精密度，7種合成色素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%～3.6%，精密度良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在空白水果樣品中，各色素添加水平均為0.050mg/kg、0.20mg/kg，按優(yōu)化好的樣品處理方法處理，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，加標(biāo)回收率為95.8%～103.9%。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)建立了水果中檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅7種人工合成色素的高效液相色譜檢測(cè)方法。方法加標(biāo)回收率95.8%～103.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 2.8%～3.6%（n=6），檢出限為 0.015～0.025mg/kg。方法的測(cè)定快速準(zhǔn)確，適用于水果中多種人工合成色素的同時(shí)檢測(cè)。