李竹英 王婷 田春燕

〔摘要〕 目的 探討參芪補肺方對大鼠肺組織紅系衍生核因子相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（gamma-glutamylcysteines-ynthetase，γ-GCS）的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平的影響。方法 將40只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組、富露施組，每組各10只。除空白組外，其余3組均采用香煙煙霧熏制和經(jīng)鼻給予脂多糖 （lipopolysaccharides，LPS）制作慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）大鼠模型，且給予相應(yīng)干預(yù)，連續(xù)灌胃30 d。于第38天對大鼠進(jìn)行麻醉并提取肺組織，通過RT-PCR法檢測Nrf2和γ-GCS的mRNA表達(dá)水平，通過免疫組化法、Western blot法檢測Nrf2和γ-GCS蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 中藥組、富露施組大鼠Nrf2、γ-GCS的mRNA和蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥組大鼠Nrf2、γ-GCS 的mRNA和蛋白表達(dá)與富露施組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），療效相當(dāng)。結(jié)論 參芪補肺方能夠通過降低Nrf2、γ-GCS的mRNA及蛋白的表達(dá)，減輕COPD大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

〔關(guān)鍵詞〕 參芪補肺方;紅系衍生核因子相關(guān)因子;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶;脂多糖;慢性阻塞性肺疾病

〔中圖分類號〕R285.5;R563? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.008

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以氣流受限且不完全可逆為特征，常呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道、肺的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)的疾病[1]。因COPD發(fā)病率與病死率逐年增長、社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)逐漸加重等，COPD的防治現(xiàn)已受到全球的廣泛重視[2-3]。研究證實氧化/抗氧化失衡是 COPD 的主要發(fā)病機制[4-7]。還原型谷胱甘肽（GSH）是一種含有巰基的抗氧化物，在維持肺上皮屏障完整性方面起核心作用，有消除體內(nèi)氧自由基（reactive oxygenspecies，ROS）、抵御外源性氧化劑對肺持續(xù)性損傷的作用。而γ-GCS又是GSH合成過程中的關(guān)鍵性限速酶，對GSH的合成起控制作用。肖敏敏[8]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激刺激γ-GCS上調(diào)，增加γ-GCS mRNA表達(dá)及活性，促進(jìn)GSH生成速率及生成量，增強GSH的抗氧化作用，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激對肺組織的損傷。除γ-GCS以外，紅系衍生核因子相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）也是一種重要的調(diào)控抗氧化基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子[9]。

前期實驗結(jié)果表明參芪補肺方治療COPD效果頗佳，該藥可以改善肺功能水平，降低COPD大鼠BALF炎癥程度，抑制COPD大鼠肺組織病理進(jìn)程，提高COPD大鼠肺組織miR-146表達(dá)，降低大鼠肺組織黏蛋白5AC水平[10-11]。本文將探討參芪補肺方對COPD大鼠肺組織Nrf2、γ-GCS的影響，并對其作用機制進(jìn)行初步研究。

1 材料

1.1? 動物

健康雌性Wistar大鼠40只，鼠齡在50 d左右，體質(zhì)量（200±30）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（黑）2008-004。

1.2? 藥物制備

參芪補肺方：黨參20 g，黃芪20 g，熟地黃15 g，補骨脂15 g，五味子15 g，淫羊藿15 g，黃精15 g，山茱萸15 g，紫菀15 g，款冬花15 g，清半夏10 g，紫蘇子15 g，地龍10 g，甘草5 g，共計200 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備（每劑56 mL，含生藥200 g）， 按照人（70 kg）與大鼠（220 g）體表面積系數(shù)0.018計算，每只大鼠每日5 mL/kg灌胃治療。富露施：將富露施（乙酰半胱氨酸顆粒）配制成185 mL的溶液（含富露施2 g），大鼠每日0.054 g/kg灌胃治療。

1.3? 主要試劑及儀器

脂多糖（LPS）（美國 Sigma 公司）;富露施：意大利贊邦集團（批號：H20000471）;大前門牌香煙（上海煙草公司生產(chǎn)）;總RNA提取TRIZOL試劑盒（美國Invitrogen公司）;自制動物煙熏箱（50 cm×65 cm×145 cm）;高速低溫離心機（Eppendorf公司）;酶標(biāo)儀（北京六一公司W(wǎng)D-9405B）;熒光定量PCR儀（美國 BIO-RAD公司）;水平電泳槽機（美國BIO-RAD公司）;甩片機（美國BIO-RAD公司）;一抗山羊抗兔Nrf2、γ-GCS（beyotime公司 A0208）;二抗山羊抗小鼠Nrf2、γ-GCS（beyotime公司 A0216）。

2 方法

2.1? 分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將40只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組、富露施組，每組10只。

2.2? 模型制備及干預(yù)

模型組、富露施組、中藥組參照崔德健[12]和趙春玲等[13]實驗方法建立COPD大鼠模型，將大鼠置于自制煙熏箱（50 cm×65 cm×145 cm）內(nèi)，箱體下側(cè)壁有一個通氣孔，箱體左頂端有排煙孔，在箱內(nèi)燃燒器內(nèi)點燃20 g香煙煙絲，待煙霧完全散去后取出各組大鼠，全程約30 min，每日1次，除滴藥日外，連續(xù)煙熏24 d。除空白組外，其余各組分別于實驗開始的第1、8、15、22天給予LPS（1 mg/mL）0.1 mL滴鼻。自實驗第9天起，中藥組大鼠每日17.86 g/kg參芪補肺方湯劑灌胃1次;富露施組每日0.054 g/kg富露施藥液灌胃1次;模型組每日0.9%NaCl5 mL/kg灌胃，共計給藥治療30 d。

2.3? 標(biāo)本采集

于實驗第38天藥物治療結(jié)束后4 h，稱質(zhì)量并2%戊巴比妥（35 mg/kg） 腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥固定于鼠板，胸部皮消毒后切開胸部暴露肺部，沿肺門剪下右肺，經(jīng)PBS漂洗后，取副葉、后葉4 ℃下固定2 h，進(jìn)行石蠟包埋及切片，片厚5 μm;前葉浸在RNA later保存液中，-80 ℃保存，留作RT-PCR檢測;中葉放入3 mLEP管中，-80 ℃保存，備用。

2.4? 標(biāo)本檢測

2.4.1? RT-PCR檢測Nrf2、？酌-GCSmRNA表達(dá)? 稱取大鼠肺組織100 mg按照說明書提取RNA，測量RNA的純度，取1 μL總 RNA用DEPC水稀釋100倍，放于酶標(biāo)儀測定 OD26O、OD280 值。按照RT-PCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取上述反應(yīng)產(chǎn)物2 μLcDNA，其中加入上下游引物各1.5 μL;TaqDNA聚合酶混合物8 μL;ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 4 min;變性：溫度94 ℃，時間30 s;退火：溫度50 ℃，時間1 min;延伸：溫度72 ℃，時間30 s;終末延伸：溫度72 ℃，時間5 min。用凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴增產(chǎn)物條帶，條帶與內(nèi)參照 GAPDH 擴增帶的吸光度比值作為其mRNA表達(dá)水平的相對指標(biāo)。各引物序列見表1。

2.4.2? 免疫組化法檢測Nrf2、？酌-GCS蛋白的表達(dá)? 將后葉切片脫蠟至水（所用試劑為二甲苯、無水、95%、85%、70%酒精、蒸餾水）。然后依次進(jìn)行滅活，暴露抗原結(jié)合位點，蒸餾水沖洗3次，用PBS按1∶100稀釋孵育一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜，二抗用PBS稀釋200倍，滴加至完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min，浸泡在PBS中5 min，重復(fù)3次，滴加SABC，DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，每組內(nèi)隨機挑選3個200倍視野的照片。

2.4.3? Western blot法檢測Nrf2、γ-GCS蛋白的表達(dá)? 分別提取各組組織蛋白，依據(jù) BCA 法蛋白含量檢測試劑盒說明測定蛋白濃度。將0.5 μg/μL的BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL體積分裝于酶標(biāo)板各孔，剩余體積用PBS緩沖液補齊至20 μL。將各組待測樣本蛋白1 μL與19 μL PBS混勻。按照A液：B液體積比50∶1制成BCA工作液，加入各孔中充分混勻后，置于37 ℃反應(yīng)20 min，將酶標(biāo)板置于載臺上，進(jìn)行讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。按照Western blot操作步驟操作，制備8%分離膠、5%濃縮膠，每個泳道各加入40 μg樣蛋白，經(jīng) SDS-PAGE 恒壓電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，用1∶500比例稀釋一抗進(jìn)行孵育; 二抗按1∶1 000比例稀釋，ECL底物發(fā)光，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2.5? 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料運用t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料運用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用卡方（？字2）檢驗。若P<0.05則有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 大鼠肺組織Nrf2、γ-GCS mRNA表達(dá)水平比較

與空白組比較，其他各組大鼠Nrf2、γ-GCSmRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.05），說明COPD大鼠模型成立;富露施組、中藥組Nrf2、γ-GCS mRNA表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）; 中藥組Nrf2、γ-GCS mRNA的表達(dá)與富露施組比較無顯著差異（P>0.05），療效相當(dāng)。提示參芪補肺方能夠緩解大鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低Nrf2、γ-GCSmRNA水平。見表2。

3.2? 大鼠肺組織Nrf2、γ-GCS蛋白表達(dá)水平比較

空白組Nrf2、γ-GCS蛋白的表達(dá)明顯低于模型組、富露施組、中藥組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;模型組Nrf2、γ-GCS蛋白的表達(dá)高于富露施組、中藥組（P<0.05），提示參芪補肺方能夠緩解大鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低Nrf2、γ-GCS蛋白水平。見表3，圖1-圖3。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，吸煙會刺激機體釋放大量ROS、炎癥細(xì)胞及氧化劑，這種大量蓄積可引起細(xì)胞毒性，造成肺組織損傷[14]。為了消除多余的氧化物質(zhì)，機體誘導(dǎo)γ-GCS增加，刺激GSH大量合成、活化，起到抗氧化作用。相關(guān)研究證實GSH不僅具有重要的抗氧化作用，而且具有維護(hù)氣道上皮完整、減輕氣道炎癥等作用[18]。Nrf2是COPD治療中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，具有調(diào)控γ-GCS基因表達(dá)的關(guān)鍵作用，在正常狀態(tài)下，Nrf2以非活化的形式存在于胞漿中，不具有抗氧化作用，但當(dāng)機體氧化/抗氧化失衡時，則可活化Nrf2，進(jìn)而促進(jìn)γ-GCS的高表達(dá)，來對抗氧化應(yīng)激，因此對于COPD的治療，可以通過增加Nrf2的活化使γ-GCS的表達(dá)快速增多，使機體產(chǎn)生更多的抗氧化物質(zhì)，從而減慢和延緩COPD惡化[15-16]。

COPD可歸為中醫(yī)學(xué)中“肺脹”的范疇，氣虛、血瘀、痰阻是COPD穩(wěn)定期的主要病機特點，調(diào)補肺腎、化痰行瘀是治療COPD穩(wěn)定期的重要治法。參芪補肺方中君藥為黃芪、黨參，黃芪補肺脾元氣、益衛(wèi)固表，黨參益氣補肺，合用增補肺益氣之效;臣藥熟地黃、黃精補腎納氣平喘，五味子斂肺止咳，補骨脂、淫羊藿補腎壯陽，共奏滋陰補腎潤肺，溫腎助陽之功;佐藥紫菀、款冬花降氣止咳，紫蘇子、清半夏、地龍斂肺化痰、祛風(fēng)平喘，山茱萸補肝益腎、收斂固澀;使藥甘草，止咳化痰，調(diào)和藥性。全方肺腎得補，痰濕得消。臨床表明運用參芪補肺方治療COPD穩(wěn)定期療效顯著[17]。

本實驗結(jié)果顯示，中藥組Nrf2、γ-GCS mRNA和蛋白的表達(dá)均低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明中藥組的氧化應(yīng)激反應(yīng)輕于模型組，參芪補肺方對COPD 有治療作用，這可能是由于通過參芪補肺方的灌胃治療，緩解并減輕了外源性氧化劑、ROS、炎癥細(xì)胞等對大鼠肺組織的持續(xù)損傷，使得Nrf2、γ-GCS mRNA和蛋白的表達(dá)相對性的降低，這為參芪補肺方治療COPD的作用機制研究提供了新思路。參芪補肺方對Nrf2、γ-GCS mRNA和蛋白表達(dá)的影響，將為COPD的治療開辟新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李正武，龍蕓蕓，饒? 媛，等.培土生金法聯(lián)合穴位敷貼治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期的臨床研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，36（8）：75-79.

[2] 喬翠霞，李素云.慢性阻塞性肺疾病的流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J].中國老年雜志，2010，30（11）：1618-1621.

[3] 許? 揚，張鵬俊，彭? 博，等.北京市某醫(yī)聯(lián)體內(nèi)社區(qū)居民對慢性阻塞性肺疾病的認(rèn)知現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2017，45（1）：57-59.

[4] 張? 洋，李永霞.炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機制中的研究進(jìn)展[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，36（1）：162-164，180.

[5] 田燕歌，李? 亞，李建生，等.調(diào)補肺腎三法對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響和遠(yuǎn)后效應(yīng)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（2）：621-624.

[6] SUNDAR I K， YAO H， RAHMAN I. Oxidative stress and chromatin remodeling in chronic obstructive pulmonary disease and smoking-related diseases[J]. Antioxid Redox Signal， 2013， 18（15）：1956-1971.

[7] 平? 芬，牛占叢，馬國強，等.N-乙酰半胱氨酸對慢性阻塞性肺疾病急性加重患者氧化應(yīng)激的影響[J].河北醫(yī)藥，2013，35（9）：1285-1287.

[8] 肖敏敏.KLF2調(diào)控Nrf2/Bach1在屋塵螨抗原處理的支氣管上皮細(xì)胞中對抗氧化應(yīng)激的作用[D].衡陽：南華大學(xué)，2012.

[9] 楊麗夢，熊旭東.Keap1-Nrf2/ARE氧化應(yīng)激信號通路與膿毒癥急性肺損傷的相關(guān)性研究[J].臨床急診雜志，2016，17（8）：590-592，596.

[10] 郅扶旻.基于黏液高分泌機制探討Nrf2對慢阻肺大鼠miR-146、MUC5AC調(diào)控及參芪補肺方的干預(yù)作用[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[11] 田春燕，李竹英.參芪補肺方對慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期大鼠Nrf2和MUC5AC表達(dá)的影響[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2016，16（36）：198-199.

[12] 宋一平，崔德健，茅培英，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重塑及生長因子的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（5）：283-287，1001.

[13] 鄒海峰，趙春玲，陳? 燕，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺牽張反射對心率的影響[J].西部醫(yī)學(xué)，2007，19（1）：9-11.

[14] 陳? 聆，李? 敏.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)和血管內(nèi)皮的改變[J].診斷學(xué)理論與實踐，2009，8（3）： 348-351.

[15] 陳? 林，戴愛國，胡瑞成.慢性阻塞性肺疾病大鼠Nrf2和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表達(dá)的改變[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24（3）：339-342.

[16] NGUYEN T， SHERRATT P J， HUANG H C， et al. Increased protein stability as a mechanism that enhances Nrf2-mediated transcriptional activation of the antioxidant response element. Degradation of Nrf2 by the 26 S proteasome[J]. J Biol Chem，2003，278（7）： 4536-4541.

[17] 王? 婷.參芪補肺方治療慢阻肺穩(wěn)定期（肺腎氣虛兼血瘀證）的臨床觀察及對血清IL-17的影響[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2017.