李明 李君 付昆

中圖分類號 R684.3；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2484-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.09

摘 要 目的：研究骨碎補總黃酮對膝骨關節(jié)炎（KOA）模型兔滑膜組織及軟骨組織/細胞中低氧誘導因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法：將30只家兔隨機分為正常組、模型組和骨碎補總黃酮低、中、高劑量組（30、60、100 mg/kg），每組6只。除正常組外，其余各組家兔均切開左膝關節(jié)，剪斷內(nèi)側副韌帶和前后交叉韌帶，完整切除內(nèi)側半月板，復制KOA模型。術后5周，各給藥組家兔灌胃相應劑量的骨碎補總黃酮，正常組和模型組家兔灌胃等容生理鹽水，每天3次，連續(xù)14 d。末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量，并考察兩者的相關性；以蘇木精-伊紅染色觀察家兔滑膜組織的形態(tài)學變化；采用免疫組化法檢測家兔軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性表達的情況；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測家兔軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的情況。結果：與正常組比較，模型組家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；滑膜表層出現(xiàn)裂隙，細胞層次不清晰且排列無序；軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性細胞數(shù)增加，軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的相對表達量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，骨碎補總黃酮各劑量組家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），且兩者呈正相關（r=0.923，P<0.01）；滑膜表面裂隙減少，細胞排列較為均勻，損傷程度減輕；軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性細胞數(shù)減少，軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的相對表達量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論：骨碎補總黃酮可減輕KOA模型兔滑膜及軟骨的損傷程度，這種作用可能與下調(diào)滑膜組織及軟骨組織/細胞中HIF-1α和VEGF的表達有關。

關鍵詞 骨碎補總黃酮；膝骨關節(jié)炎；低氧誘導因子1α；血管內(nèi)皮生長因子；兔；滑膜；軟骨

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of total flavonoids of Drynariae rhizoma on the expression of HIF-1α and VEGF in synovial tissues and cartilage tissues/cells of knee osteoarthritis （KOA） model rabbits. METHODS： Totally 30 rabbits were randomly divided into normal group， model group and total flavonoids of D. rhizoma low-dose， medium-dose and high-dose groups （30， 60， 100 mg/kg）， with 6 rabbits in each group. Except for normal group， KOA model of rabbits was induced in other groups by cutting the left knee joint， shearing off the medial collateral ligament， anterior and posterior cruciate ligaments， and completely removing the medial meniscus. Five weeks after surgery， administration groups were given relevant dose of total flavonoids of D. rhizoma intragastrically； normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， 3 times a day， for consecutive 14 d. After last medication， the contents of HIF-1α and VEGF in synovial tissues of rabbits were detected by ELISA， and the relationship of them was investigated. HE staining was used to observe the morphology of the synovial tissues； immunohistochemical staining was used to detect the positive expression of HIF-1α and VEGF in cartilage tissues； protein expression of HIF-1α and VEGF in cartilage cells was detected by Western blot method. RESULTS： Compared with normal group， the contents of HIF-1α and VEGF in synovial tissues of rabbits in model group were increased significantly， with statistical significance （P<0.01）； synovial tissues surface appeared fissures， and the cell layers were not clear and arranged in disorder； the number of positive cells of HIF-1α and VEGF in cartilage tissues was increased， and the relative expression of HIF-1α and VEGF in cartilage cells was increased significantly， with statistical significance （P<0.01）. Compared with model group， the contents of HIF-1α and VEGF in synovial tissues of rabbits were decreased significantly in total flavonoids of D. rhizoma groups， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）， showing positive relationship （r=0.923，P<0.01）； the fissures were reduced， and the cell arrangement was more uniform， the degree of synovium injury was reduced； the number of positive cells of HIF-1α and VEGF in cartilage tissues was decreased， and the relative expression of HIF-1α and VEGF in cartilage cells was decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Total flavonoids of D. rhizoma can relieve synovium and cartilage injury in KOA model rabbits， the effect of which may be associated with regulating the expression of HIF-1α and VEGF in synovial tissues and cartilage tissues/cells.

KEYWORDS Total flavonoids of Drynariae rhizoma； Knee osteoarthritis； HIF-1α； VEGF； Rabbit； Synovium； Cartilage

膝骨關節(jié)炎（KOA）是一種在全世界范圍內(nèi)較為普遍的且以膝關節(jié)軟骨退變性疾病和在膝關節(jié)周圍形成骨質(zhì)增生為主要特征的疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)，KOA的核心為膝關節(jié)軟骨退行性病變，并伴有多種組織如骨質(zhì)、關節(jié)、滑膜等結構的慢性炎癥[1]。有研究表明，不同組合的生長因子會以協(xié)同或拮抗的方式影響軟骨細胞的增殖，在防治關節(jié)軟骨病變上可能具有重要的意義[2]。缺氧誘導因子1α（HIF-1α）是調(diào)控機體無氧代謝的重要因子，其對關節(jié)軟骨細胞的增殖、凋亡以及維持正常關節(jié)軟骨細胞代謝等均有重要作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是調(diào)控血管生成的重要因子之一，是HIF-1α的重要靶點，對新生血管的快速形成、軟骨細胞的存活、骨轉(zhuǎn)換速率等均具有調(diào)控作用[4]。

在眾多KOA治療方法中，中藥治療是療效較為突出的方法之一。相關研究顯示，骨碎補總黃酮（為強骨膠囊主成分）在防治骨質(zhì)疏松癥、骨量減少中具有重要作用[5]，且用以治療KOA效果明顯[6]。有研究者發(fā)現(xiàn)，微骨折技術聯(lián)合骨碎補總黃酮對實驗性兔膝關節(jié)損傷具有一定的修復作用，但具體機制尚未闡明[7]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮可有效減輕KOA模型兔的滑膜損傷程度。在此基礎上，本研究以KOA模型兔為對象，進一步檢測了給予骨碎補總黃酮后家兔滑膜組織及軟骨組織/細胞中HIF-1α和VEGF的表達水平，初步探討了骨碎補總黃酮治療KOA的可能機制，以期為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

FLUOstar Omega型全自動多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司）；E-Gel Imager凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BX-50型顯微鏡（日本Olympus公司）；Z446K型通用冷凍離心機（德國Hermle公司）；MTC型冷凍切片機（德國SLEE公司）；ATK-7型生物組織攤烤片機（湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司）；DHG-9245A型醫(yī)用烤箱（佛山市迅優(yōu)電子有限公司）；BWY型標準恒溫搖床、HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海丙林電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

骨碎補總黃酮[強骨膠囊，北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20030007，批號：080102020，規(guī)格：每粒裝0.25 g（以蘆丁作標準，每粒約含總黃酮8.75 mg）]；硫酸慶大霉素片[福安藥業(yè)集團煙臺只楚藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H37020905，批號：P20091030269919，規(guī)格：40 mg（4萬單位）]；戊巴比妥鈉（國藥集團上?；瘜W試劑有限公司，批號：T20060816），上述藥物使用前均用生理鹽水溶解。Ⅱ型膠原酶（上海翊圣生物科技有限公司，批號：40508ES60）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：W026）；VEGF試劑盒（批號：HB-65A044）、HIF-1α試劑盒[批號：JK-（a）-E00921]均購自上海晶抗生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液（上?？道噬锟萍加邢薰?，批號：KL-F112）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（蘇州瑞諾德生物科技有限公司，批號：25800035）；鼠抗兔單克隆HIF-1α抗體（批號：F675432J）及二抗（批號：F768643）、鼠抗兔單克隆VEGF抗體（批號：B567432P）及二抗（批號：B59874R）、鼠抗兔單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號：GY76532R）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（批號：F54763）、免疫印跡化學發(fā)光（ECL）試劑（批號：ECL76843）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

新西蘭家兔30只，雌性，6月齡，體質(zhì)量（2.41±0.32）kg，由上海中醫(yī)藥大學提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2004-0004]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

30只家兔適應性喂養(yǎng)1周后，將其隨機分為正常組、模型組和骨碎補總黃酮低、中、高劑量組（30、60、100 mg/kg，參照本課題組前期實驗根據(jù)兔體表面積按成人劑量的3/50、3/25、1/5換算而得），每組6只。除正常組外，其余各組家兔均參照文獻[8]方法復制KOA模型：于耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（劑量為35～40 mg/kg）進行麻醉后，剃除其膝關節(jié)周圍的毛發(fā)，隨后予碘伏消毒，將左膝關節(jié)切開，剪斷內(nèi)側副韌帶和前后交叉韌帶，完整切除內(nèi)側半月板。術中不作固定，并注意對關節(jié)軟骨面進行保護使其不受損傷；術后亦不作固定，分籠飼養(yǎng)，并肌內(nèi)注射慶大霉素（劑量為4萬單位/d），連續(xù)3 d。術后5周（家兔KOA模型復制成功），各給藥組家兔灌胃相應劑量的骨碎補總黃酮，正常組和模型組灌胃等容生理鹽水，每天3次，連續(xù)14 d。

2.2 滑膜組織中HIF-1α和VEGF含量的檢測

末次給藥后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（劑量為35～40 mg/kg）進行麻醉并處死各組家兔，取出其膝關節(jié)滑膜，迅速投入4 ℃、10%中性多聚甲醛中，取樣過程不超過8 min。稱取上述滑膜組織100 mg，破碎，勻漿，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以全自動多功能酶標儀檢測滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量，并考察兩者的相關性。檢測波長為405 nm，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.3 滑膜組織形態(tài)學觀察

取上述經(jīng)固定的各組家兔滑膜組織適量，用乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣、乙醇脫水、石蠟包埋后，切片（厚度約4～5 μm）。切片在42 ℃水中展開，以載玻片撈片，置62 ℃攤烤片機中烘片1 h，隨后置72 ℃醫(yī)用烤箱中烤片2 h，行蘇木精-伊紅（HE）染色，經(jīng)75%、85%、90%、95%、100%乙醇逐級脫水各2 min，以二甲苯透明、中性樹膠封片后，置顯微鏡下觀察滑膜組織形態(tài)學變化。

2.4 軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性表達的檢測

采用免疫組化法（SP）檢測各組家兔軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性表達的情況。取各組家兔軟骨組織適量，于4 ℃、10%中性多聚甲醛中固定，經(jīng)EDTA脫鈣、乙醇脫水、石蠟包埋后，切片（厚度約4～5 μm）。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法對上述切片進行處理，并依次經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，滴加雙氧水進行抗原修復，依次加入HIF-1α和VEGF一抗、二抗（加入量分別均為1 ∶ 500、1 ∶ 1 000）進行孵育，經(jīng)DAB顯色后，再用蘇木精復染，經(jīng)常規(guī)脫水、透明封片后，置于顯微鏡下觀察、讀取陽性細胞數(shù)。每組隨機選取5個視野，重復6次，取平均值。用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.0）代替一抗作陰性對照。其中，VEGF定位于細胞漿或細胞核，HIF-1α定位于細胞漿及細胞核中，在無背景著色的情況下，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性。

2.5 軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測各組家兔軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的情況。離斷各組家兔關節(jié)及其周圍肌肉組織，剔除軟組織，用尖刀片削取透明軟骨，以PBS 2 mL清洗3次后，加入2% Ⅱ型膠原酶4 mL，置37 ℃恒溫搖床中振蕩消化，直至組織變?yōu)樾鯛罴毎鞈乙?。將上述混懸液?jīng)濾網(wǎng)濾過后，收集軟骨細胞分別按2 000個/孔、5 000個/cm2接種于96孔板及培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用顯微鏡觀察細胞生長情況。取上述對數(shù)生長期家兔軟骨細胞適量，通過Bradford法調(diào)整蛋白濃度后，采用SDS-PAGE分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)麗春紅S染色后，按目標條帶剪膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液于室溫下封閉2 h，分別加入相應一抗[HIF-1α（1 ∶ 2 000）、VEGF（1 ∶ 5 000）、GAPDH（1 ∶ 2 000）]，于4 ℃下孵育過夜后，于室溫下以TBST溶液洗膜，加入相應二抗（1 ∶ 1 000），孵育2 h后，用TBST溶液洗膜，以ECL顯色，37 ℃普通膠片曝光，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描，采用Image J 7.0軟件計算條帶的光密度值，以相應蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的光密度比值作為該蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）；HIF-1α和VEGF含量的相關性評價采用Pearson相關性分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 骨碎補總黃酮對家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF含量的影響

與正常組比較，模型組家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，骨碎補總黃酮各劑量組家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF含量的相關性

通過對KOA模型兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF含量的相關性進行分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關（r=0.923，P<0.001）。

3.3 骨碎補總黃酮對家兔滑膜組織形態(tài)學的影響

正常組家兔的滑膜表面較為光滑，細胞分布較為均勻且排列較為整齊。模型組家兔的滑膜表層有裂隙出現(xiàn)，細胞層次不清晰且排列無序，出現(xiàn)了成簇細胞。與模型組比較，骨碎補總黃酮各劑量組家兔的滑膜表面裂隙明顯減少，細胞分布更為均勻，損傷程度明顯減輕；骨碎補總黃酮各劑量組中，高劑量組家兔滑膜組織中細胞的分布更為均勻，細胞排列更為整齊，層次更清晰，詳見圖1。

3.4 骨碎補總黃酮對家兔軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性表達的影響

正常組家兔的軟骨組織中可見HIF-1α和VEGF的表達，即少量均勻分布的棕黃色陽性細胞（圖中色深者，下同）；與正常組比較，模型組家兔的軟骨組織中有多而密集的棕黃色陽性細胞，提示HIF-1α和VEGF的表達明顯增加；與模型組比較，骨碎補總黃酮各劑量組家兔的軟骨組織中陽性細胞數(shù)明顯減少，提示HIF-1α和VEGF的表達明顯減少，詳見圖2。

3.5 骨碎補總黃酮對家兔軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組家兔軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的相對表達量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，骨碎補總黃酮各劑量組家兔軟骨細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的相對表達量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表2。

4 討論

KOA是一種慢性進行性退行性疾病，在病理情況下，骨/軟骨接合處以及滑膜中的血管分布明顯增加。在此過程中，VEGF能特異性地結合血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞生長，增加血管通透性，從而對血管新生具有重要的促進作用[9]。VEGF作為最重要的促血管生成因子，積極參與了KOA的病理過程[9-10]。Pfander D等[11]的研究也表明，與健康受試者比較，KOA患者關節(jié)軟骨中VEGF陽性細胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。此外有研究指出，氧濃度較低會加劇KOA的病情進展，這是由于在KOA發(fā)病過程中，機體中的細胞和組織會產(chǎn)生一系列的適應性缺氧反應（如促使細胞內(nèi)能量代謝途徑逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧酵解途經(jīng)、新生血管形成及全身紅細胞合成增加等）[12]；在這種低氧情況下，HIF-1α可對其他生長因子的表達進行重點調(diào)控，廣泛參與血管生長和發(fā)展的整個過程，并進一步影響軟骨細胞的代謝[3]。VEGF是HIF-1α的作用靶點之一，HIF-1α上調(diào)VEGF表達促血管新生的機制可能為：在其他輔助激活因子作用下，HIF-1α啟動VEGF轉(zhuǎn)錄，并增強缺氧時VEGF mRNA的穩(wěn)定性，最后對VEGF RNA轉(zhuǎn)錄進行上調(diào)，以加強其生物學效應[4，9]。有研究指出，在敲除HIF-1α編碼基因后，關節(jié)炎模型動物的滑膜細胞增殖和血管翳形成均有所減少，其關節(jié)軟骨被破壞及腫脹程度得以緩解[13-14]。

本研究在前期研究的基礎上，探討了骨碎補總黃酮對KOA模型兔滑膜組織及軟骨組織/細胞中HIF-1α和VEGF表達水平的影響。結果顯示，KOA模型兔給予不同劑量的骨碎補總黃酮后，其滑膜表面裂隙較模型組明顯減少，損傷程度明顯減輕，細胞分布更為均勻，且骨碎補總黃酮各劑量組中高劑量組家兔滑膜組織中的細胞分布更為均勻，排列更為整齊，層次更清晰。同時，骨碎補總黃酮各劑量組家兔的軟骨組織中HIF-1α和VEGF陽性細胞數(shù)明顯減少，滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量均顯著下降，軟骨組織/細胞中HIF-1α和VEGF的表達均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義，提示骨碎補總黃酮可顯著抑制滑膜及軟骨組織/細胞中HIF-1α和VEGF的表達。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在家兔滑膜組織中HIF-1α和VEGF的含量呈正相關，進一步證實了VEGF是HIF-1α的作用靶點之一，HIF-1α能上調(diào)VEGF的表達，VEGF也可逆反饋HIF-1α的表達。

綜上所述，骨碎補總黃酮可減輕KOA模型兔滑膜及軟骨的損傷程度，這種改善作用可能與下調(diào)滑膜及軟骨組織/細胞中HIF-1α和VEGF的表達有關。但本研究僅以HIF-1α和VEGF為考察指標，而其余多種生長因子間的協(xié)同作用及其機制仍有待后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2018-03-08 修回日期：2018-07-11）

（編輯：張元媛）