翁可佳　沙爾格　沙馬五?！〗鸸盼橹А●R丹煒

摘要：[目的]探討土荊芥腐解液對蠶豆幼苗光合特性和保衛(wèi)細胞活性的影響，為揭示土荊芥的入侵機制提供理論依據(jù)。[方法]采用表皮條分析法和盆栽試驗，分析土荊芥腐解液作用下蠶豆幼苗株高、地上部鮮重和干重、葉面積、實際光化學效率（ФPsⅡ）和最大光化學效率（F_v/F_m）等指標的變化情況，并檢測保衛(wèi)細胞的活性及細胞核異常率。[結果]土荊芥腐解液處理蠶豆幼苗的葉面積變化不明顯，但地上部生物量和株高顯著下降（P<0.05，下同），且具有時間和濃度依賴性；土荊芥腐解液處理蠶豆葉片的葉綠素熒光參數(shù)F_v/F_M和ФPsⅡ均發(fā)生不同程度變化，但與對照（CK）均無顯著差異（P>0.05）。在土荊芥腐解液的作用下，蠶豆葉片的保衛(wèi)細胞活性降低，細胞核出現(xiàn)錯位、固縮、拉長或降解等畸變特征；隨腐解液濃度的增加，保衛(wèi)細胞死亡率及細胞核畸變率顯著升高。[結論]土荊芥腐解液對蠶豆幼苗的光反應影響不明顯，但其較強的細胞毒性能引起葉片氣孔保衛(wèi)細胞發(fā)生畸變，活性降低，進而導致幼苗氣孔運動受阻，吸收c02的能力下降，光合效率降低而影響幼苗生長發(fā)育。

關鍵詞：土荊芥腐解液；蠶豆幼苗；化感作用；細胞毒性；光合特性

中圖分類號：S643.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）03-0530-06

0引言

[研究意義]土荊芥（Chenopodium ambrosioi—des L.）又名紅澤藍、殺蟲芥、鵝腳草等，為藜科藜屬一年或多年生芳香性草本植物（Monzote et a1.，2014），廣泛分布于我國20多個?。▍^(qū)），是當?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中的單優(yōu)種群，對我國的生態(tài)系統(tǒng)造成了極大威脅（徐海根和強勝，2004）。土荊芥較強的入侵性與其強烈的化感作用密切相關，其向環(huán)境釋放的化感物質(zhì)干擾周圍植物的代謝過程，破壞細胞結構甚至引起細胞凋亡，進而抑制周圍植物的生長發(fā)育（Jim6nez-Osomio et a1.，1996；胡琬君等，2011；胡忠良等，2015；Chert et a1.，2016）。蠶豆作為蔬菜作物廣泛種植于土荊芥入侵的農(nóng)田（胡琬君等，2012），因此，以蠶豆為受體，分析土荊芥腐解液對其光合特性和保衛(wèi)細胞活性的影響，對揭示土荊芥的化感作用機制和入侵機制具有重要意義。[前人研究進展]目前，針對土荊芥化感作用的研究主要集中在其揮發(fā)性化感物質(zhì)對根細胞的影響方面（胡琬君等，2011；胡忠良等，2015；Chen et a1.，2016），而關于其對周圍植物光合特性影響的研究較少。張紅等（2010）、李安奇等（2012）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土荊芥的凋落物數(shù)量較多，其腐解過程釋放的化感物質(zhì)對周圍植物的生長發(fā)育具有抑制效應。王毅和儀慧蘭（2013）、李蕊等（2015）研究認為，蠶豆是觀察保衛(wèi)細胞氣孔活動的模式植物，其保衛(wèi)細胞對許多脅迫因子如甲醛、S02和鋁等反應十分靈敏，常被用作評估環(huán)境脅迫的受試系統(tǒng)。孫慧群等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，氣孔保衛(wèi)細胞能靈敏準確地響應環(huán)境脅迫，并通過復雜的信號調(diào)控改變其膨壓，從而使氣孔處于最適宜的開閉狀態(tài)。周健等（2016a，2016b）研究發(fā)現(xiàn)，蠶豆葉片保衛(wèi)細胞能敏感響應入侵植物的化感作用，在土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)和辣子草水浸提液作用下均表現(xiàn)為活性降低，甚至出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。[本研究切入點]植物生長依賴于光合作用制造的有機物，葉綠素熒光參數(shù)能直接反映植物光合系統(tǒng)對光能的吸收和利用情況（王鷹翔等，2017），由于葉片表面的角質(zhì)層幾乎不能透過水分和C02，即氣孔開關運動在葉片內(nèi)外的氣體交換尤其是光合作用和蒸騰作用中發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用（許大全，2013）。目前，有關土荊芥腐解物對與蠶豆生長發(fā)育密切相關的葉綠素特性和氣孔特性影響的研究鮮見報道。[擬解決的關鍵問題]運用盆栽試驗和表皮條分析法，分析土荊芥腐解液對蠶豆幼苗生長、葉綠素熒光參數(shù)和葉表皮氣孔保衛(wèi)細胞的影響，旨在探討土荊芥殘株腐解的化感作用機制，為揭示土荊芥的入侵機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試土荊芥植株采自四川省成都市錦繡大道附近，陰干后備用。蠶豆種子購自成都市龍泉驛區(qū)大面鎮(zhèn)種子市場，品種為成胡14號。供試土壤取自四川師范大學成龍校區(qū)，土壤類型為黃壤。

1.2試驗方法

1.2.1腐解液制備 分別稱取土荊芥陰干葉片和土壤各0.15 kg，置于塑料桶中，加入6 L蒸餾水，蓋上蓋子置于25℃的溫室中進行腐解處理，處理時間40 d，其間不定期攪拌。處理結束后先用32層紗布過濾2次，濾液再用濾紙過濾1次，得到濃度為25.0mg/L的腐解母液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。設4個腐解液濃度梯度，即10.0、15.0、20.0和25.0 mg/L，以蒸餾水處理為對照（CK）。

1.2.2材料培養(yǎng) 將撿去植物根系、石頭、落葉和枯枝的土壤分裝于小花盆（直徑7 cm，高度6 cm）中；挑選大小均一、飽滿的蠶豆種子，用0.5%KMnO₄溶液消毒15 min，浸種24 h，避光，25℃催芽2～3 d。待種子露白后播種至小花盆中，每盆1粒種子，置于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照和黑暗各12 h，溫度25℃。

1.2.3幼苗生長指標及葉綠素熒光參數(shù)測定 材料培養(yǎng)1周后隨機分為5組，分別用不同濃度腐解液和蒸餾水進行澆灌，每盆澆灌10 mL，之后不定期補充水分以保持土壤濕潤。每周定期測定植株地上部高度和葉綠素熒光參數(shù)，4周后測定葉面積、地上部鮮重和干重。植株高度為用直尺測量蠶豆幼苗植株地上部的高度。鮮重和干重測定：試驗結束后，剪取幼苗地上部稱取鮮重，然后置于烘箱中105℃殺青，80℃烘至恒重，稱重，每處理測定10株。葉面積測定：每株選取頂端第2層的1片葉片，采用AM300葉面積測定儀測量葉面積，每處理測定10株。葉綠素熒光參數(shù)測定：選取每株蠶豆頂端第2層的1片葉片，暗處理30 min后，采用FMS一2便攜式熒光測定儀測定其實際光化學效率（ФPsⅡ）和最大光化學效率（F_v/F_m）。每組測定10株。

1.2.4細胞毒性試驗 采用表皮條分析法，參照周健等（2016a）的方法進行細胞毒性試驗。分別取不同濃度土荊芥腐解液6μL，加入裝有5 mL表皮緩沖液[50 mmol/L KCl，0.1 mmol/L CaCl₂，0.1 mol/LTris，10 mmol/L 2-（N-morpholino）ethane sulfonicacid（MES），pH 7.0]的EP管中；取生長4～5周蠶豆幼苗完全展開的頂端葉片，用鑷子撕取1.0 cm×0.5 cm的下表皮浸入處理液中，每個EP管放置8片，每處理重復5次，以浸泡蒸餾水為對照（CK），置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，分別采用AO/EB染色法和孚爾根染色法檢測保衛(wèi)細胞的活性和核異常率（周健等，2016a，2016b）。具有綠色熒光的為活細胞，具有橘紅色熒光的為死細胞。

細胞死亡率（%）=死細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100

細胞核異常率（%）=核異常細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100

1.3統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0對測定參數(shù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（LSD），以Excel2007制圖。

2結果與分析

2.1土荊芥腐解液對蠶豆幼苗生長的影響

由表1可知，從第2周起，20.0 mg/L腐解液處理蠶豆幼苗的株高均顯著低于CK（P<0.05，下同），處理后第4周，15.0 mg/L腐解液處理蠶豆幼苗的株高也顯著低于CK，說明隨著處理時間的延長，15.0和20.0 mg/L土荊芥腐解液均能顯著抑制蠶豆幼苗苗高生長。隨腐解液濃度的增加，蠶豆幼苗葉面積呈先增大后縮小的變化趨勢，當腐解液濃度達25.0mg/L時，葉面積較CK下降了7.67%，但各腐解液處理及CK間差異不顯著（P>0.05，下同），說明土荊芥腐解液對蠶豆葉片生長的影響不明顯。在土荊芥腐解液作用下，蠶豆幼苗地上部生物量發(fā)生不同程度的變化，其中15.0 mg/L腐解液處理蠶豆幼苗的地上部鮮重和干重均顯著小于CK，分別為CK的81.23%和85.71%，其他濃度的腐解液處理蠶豆幼苗地上部鮮重和干重與CK差異不顯著，說明15.0 mg/L土荊芥腐解液對蠶豆幼苗地上部生長具有抑制效應。

2.2土荊芥腐解液對蠶豆幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表2可知，不同濃度土荊芥腐解液處理蠶豆幼苗的F_v/F_m和ФPsⅡ在不同處理時間段存在一定差異，但相互問及與CK的差異不顯著，說明土荊芥腐解液對蠶豆幼苗的原初光能轉化效率影響不明顯。

2.3土荊芥腐解液對蠶豆葉片保衛(wèi)細胞活性的影響

從圖1可看出，經(jīng)土荊芥腐解液處理的蠶豆保衛(wèi)細胞，其細胞核呈橘紅色的保衛(wèi)細胞比例明顯高于CK，CK的大部分保衛(wèi)細胞核呈亮綠色，說明土荊芥腐解液處理的蠶豆保衛(wèi)細胞以死細胞居多。統(tǒng)計保衛(wèi)細胞死亡率發(fā)現(xiàn)，土荊芥腐解液處理蠶豆葉片的保衛(wèi)細胞死亡率總體上隨土荊芥腐解液濃度的增加而顯著升高（圖2-A），說明其細胞活性均明顯低于CK，呈濃度依賴關系即土荊芥腐解液可誘導蠶豆保衛(wèi)細胞死亡。

從圖3可看出，25.0 mg/mL土荊芥腐解液處理蠶豆的保衛(wèi)細胞核形態(tài)不規(guī)則，表現(xiàn)為核錯位、固縮、拉長或降解等畸變特征，保衛(wèi)細胞核畸變率隨腐解液濃度的增加而顯著升高（圖2-B）；而CK的保衛(wèi)細胞核位于細胞中間，形態(tài)規(guī)則。說明土荊芥腐解液對蠶豆保衛(wèi)細胞核形態(tài)具有顯著影響。

3討論

化感作用是外來植物成功入侵的機制之一（Ci-pollini et a1.，2012），擴散到新生境的入侵植物個體比原產(chǎn)地具有更強的化感作用，入侵植物通過根系分泌、淋溶、揮發(fā)和腐解等途徑將化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中，改變周圍植物的多種生理過程，抑制周圍植物生長發(fā)育（zhou and Yu，2006），從而在競爭中占據(jù)優(yōu)勢地位（cauaway et a1.，2011）。土荊芥為一年生或多年生草本植物，其地上部凋落后必然會進入土壤中腐解并釋放化感物質(zhì)。張紅等（2010）研究表明，土荊芥去精油殘渣腐解液對受體幼苗生長具有抑制效應，但隨著處理時間延長，抑制效應逐漸減弱。本研究結果與其略有不同，在土荊芥腐解液作用下，蠶豆幼苗的葉面積變化不明顯，植株高度和生物量整體降低，地上部生長受到抑制，且隨處理時間的延長，抑制效應明顯增強，可能是本研究供試腐解液來自未經(jīng)處理的凋落物，其化感物質(zhì)成分不同所致。

葉綠素熒光參數(shù)能很好地反映植物與逆境脅迫的關系。ФPsⅡ是判斷植物光合能力的重要指標，是光化學途徑中的激發(fā)能占進入PSⅡ總激發(fā)能的比例，而F_v/F_m是PsⅡ的最大光化學效率（孫園園等，2015），常用來度量葉片PSⅡ反應中心捕獲激發(fā)能的效率。本研究結果表明，土荊芥腐解液雖然對蠶豆葉片F(xiàn)_v/F_m和ФPsⅡ具有不同程度的影響，但與CK的差異均不顯著。因此，土荊芥腐解液對蠶豆葉的光反應影響不明顯。

CO₂和水分是植物光合作用的原料，任何影響植物體內(nèi)CO₂濃度和水分含量的因素都會影響植物的光合效率。氣孔對植物C02吸收和水分蒸騰具有調(diào)節(jié)功能，因此，任何改變氣孔功能的因素均會影響光合作用過程和植物產(chǎn)量。侯利欽等（2016）、周健等（2016a）研究發(fā)現(xiàn)，氣孔保衛(wèi)細胞可對多種環(huán)境刺激作出反應，當受到土荊芥揮發(fā)性化感物質(zhì)脅迫時，氣孔保衛(wèi)細胞活性降低，細胞核出現(xiàn)畸變現(xiàn)象。本研究結果與其相似，蠶豆保衛(wèi)細胞在土荊芥腐解液的作用下，其活性隨著腐解液濃度的增加而顯著下降，死亡率急劇上升，且細胞核出現(xiàn)錯位、固縮、拉長或降解等畸變特征。

根據(jù)本研究結果推測，土荊芥腐解過程中釋放的化感物質(zhì)主要通過影響蠶豆葉片氣孔運動而改變其體內(nèi)的CO₂濃度，從而抑制蠶豆幼苗的生長。

4結論

土荊芥腐解過程中釋放的化感物質(zhì)對蠶豆幼苗的光反應影響不明顯，但其較強的細胞毒性能引起葉片氣孔保衛(wèi)細胞發(fā)生畸變，活性降低，進而導致幼苗氣孔運動受阻，吸收CO₂的能力下降，光合效率降低而影響其生長發(fā)育。

致謝：本研究在試驗階段得到四川師范大學細胞生物學專業(yè)研究生周健和黃素的大力幫助，謹表謝忱！

（責任編輯 思利華）