張艷雯 何永權(quán) 吳云月 于冬玲 曾文榜 寧志鵬

摘要：【目的】明確廣西雞源H9N2亞型禽流感病毒（AIV）的分子遺傳變異規(guī)律及其對公共衛(wèi)生安全的影響，為H9亞型禽流感（AI）的防控提供參考依據(jù)?！痉椒ā繌膹V西某肉雞養(yǎng)殖場采集病料，經(jīng)SPF雞胚接種進行病毒分離，對初步鑒定為H9亞型AIV分離株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8個基因片段進行克隆測定及遺傳進化分析，同時對分離毒株的生物學(xué)特性進行測定。【結(jié)果】從廣西發(fā)病雞群中分離獲得一株H9N2亞型AIV，命名為A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）。分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）HA基因的裂解位點為PSRSSR↓GLF，具有典型的低致病性AIV（LPAIV）分子特征，在遺傳進化關(guān)系上屬于4.2.5分支，與國內(nèi)常用H9N2亞型AIV疫苗株所屬的4.2.3分支存在一定差異；其他7個基因也分別來源于不同的AIV亞型。分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）同時具備與α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受體結(jié)合的特性，且具有感染人類的潛在風(fēng)險；其感染雞群后病毒分布主要集中在氣管、肺臟和脾臟，可通過呼吸道和消化道同時排毒，且在攻毒后第1 d即開始排毒，第5 d為排毒高峰?！窘Y(jié)論】從廣西發(fā)病雞群中分離獲得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）屬于LPAIV，是由不同亞型AIV重組產(chǎn)生的H9N2亞型新毒株，可導(dǎo)致雞群疫苗免疫失敗，且具有感染人類的潛在風(fēng)險。

關(guān)鍵詞： 禽流感病毒（AIV）；H9N2亞型；分離鑒定；遺傳進化；裂解位點；受體結(jié)合特性；廣西

中圖分類號： S858.31 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）04-0780-07

Isolation and identification of H9N2 subtype avian influenza virus from chicken in Guangxi and its genetic evolution

ZHANG Yan-wen1，2， HE Yong-quan3， WU Yun-yue1， YU Dong-ling1，

ZENG Wen-bang1， NING Zhi-peng1

（1Nanning University， Nanning 530200， China； 2The State Key Laboratory of Virology， Wuhan 430072， China；

3 Nanning Shanfeng Agriculture and Livestock Husbandry Investment Co.， Ltd.， Nanning 530000， China）

Abstract：【Objective】This study determined molecular genetic variation regularity of H9N2 subtype avian influenza virus（AIV） and its effects on public health safety of human so as to provide reference for the prevention and control of H9 subtype avian influenza（AI）. 【Method】Suspected tissue samples were collected from one chicken farm in Guangxi， viral isolation was performed by inoculating SPF chicken embryo. The virus was preliminarily identified as H9 subtype AIV isolated strain. Then eight gene fragments isolated from H9 subtype AIV including HA，NA，PB2，PB，PA，NP，M and NS were sequenced， and their genetic evolution was analyzed. The biological characteristics of the isolated strain were also determined at the same time. 【Result】A H9N2 subtype AIV strain， named A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2），was successfully separated from the sick chicken population in Guangxi. The cleavage site of HA gene in A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2） was PSRSSR↓GLF， which had typical features of low pathogenic AIV（LPAIV） molecule. In genetic evolution relation，it belonged to 4.2.5 branch， and had some differences with the domestic H9N2 subtype AIV vaccine strains which belonged to 4.2.3 branch. The other seven genes were also derived from different AIV subtypes. The isolated virus strain A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2） could bind to α-2，3 sialic acid and α-2，6 sialic acid receptors， with the potential risk to infect human. Virus distribution was mainly concentrated in trachea， lung and spleen after it infected chicken， and the virus also could be released through the respiratory tract and digestive tract at same time. The virus was released from day 1 and peaked on the day 5 after the chicken was infected. 【Conclusion】A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2），isolated from Guangxi sick chicken population， belonged to LPAIV. It is a H9N2 subtype new virus created by different subtypes AIV. It can lead to the failure of chicken vaccine immunization and has the potential risk of infecting human beings.

Key words：avian influenza virus（AIV）；H9N2 subtype； isolation and identification； genetic evolution； cleavage site； receptor-binding specificity； Guangxi

0 引言

【研究意義】禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類呼吸道傳染病。AIV基因組由8個大小不同的基因片段組成，分別為HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS（韋平和秦愛建，2008），因其開放閱讀框（ORF）的不同可編碼至少12種蛋白（譚偉和謝芝勛，2014）。根據(jù)病毒表面糖蛋白（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，AIV可劃分為18個HA亞型和11個NA亞型（Tong et al.，2013；Zhu et al.，2013；吳青等，2017）；而依據(jù)AIV對SPF雞致病性的強弱，又將其分為高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）兩種類型（王秀榮和陳化蘭，2015）。H9N2亞型AIV屬于LPAIV，但其感染雞群后會引起免疫抑制，進而導(dǎo)致其他病原體感染率上升，增加發(fā)病雞群因繼發(fā)或混合感染引起的死亡率。同時，H9N2亞型AIV可直接感染人類或為其他流感病毒感染人類提供內(nèi)部基因，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全（魏寶之，2013）。因此，加強H9N2亞型AIV遺傳變異規(guī)律研究對有效防控AI具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】1994年，陳伯倫等從我國廣東的發(fā)病雞群中首次分離獲得H9N2亞型AIV，隨后H9N2亞型AIV在我國多個?。▍^(qū)）暴發(fā)和流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（顧敏等，2015）。H9N2亞型AIV某些特異性受體結(jié)合位點的突變可致使其跨越種屬屏障而感染哺乳動物及人類（王愛榮，2015），1997年在廣東和香港相繼出現(xiàn)H9N2亞型AIV直接感染人類并表現(xiàn)出嚴重臨床癥狀的病例（郭元吉等，1999；Peiris et al.，1999），隨后大量研究證實，H9N2亞型AIV可為H10N8、H6N1、H7N9和H5N6亞型AIV感染人類時提供內(nèi)部基因（Liu et al.，2013，2014；Chen et al.，2014；Xu et al.，2016）。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對H9N2亞型AIV流行病學(xué)及其遺傳變異情況進行深入研究分析，發(fā)現(xiàn)該亞型病毒的HA基因變異速率在不斷加快，且其內(nèi)部基因的構(gòu)成及來源也越來越復(fù)雜，導(dǎo)致疫苗免疫失敗及人類感染事件時有發(fā)生（孟芳等，2016；楊均等，2016；張靜等，2016；Wei et al.，2016；Pan et al.，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于廣西H9N2亞型AIV流行病學(xué)及其基因組測序的研究已有報道（謝芝勛等，2007；屈素潔等，2016），但針對該亞型病毒尤其是雞源H9N2亞型AIV在廣西地區(qū)遺傳變異的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從呈現(xiàn)呼吸道癥狀的肉雞群中采集病料，經(jīng)SPF雞胚接種進行病毒分離，對初步鑒定為H9亞型AIV分離株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8個基因片段進行克隆，并通過測序分析和構(gòu)建遺傳進化樹，明確廣西雞源H9N2亞型AIV的分子遺傳變異規(guī)律及其對公共衛(wèi)生安全的影響，進而為H9亞型AI的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2016年廣西某肉雞養(yǎng)殖場35日齡的三黃雞群疑似感染AIV，患病肉雞主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)其腺胃乳頭凹凸不平，個別乳頭有出血點，支氣管有干酪樣栓塞。該雞群在12日齡時進行過H9亞型AIV滅活苗免疫。病毒分離材料為發(fā)病雞的肺臟和支氣管；SPF雞胚由北京梅里亞維通實驗動物有限公司提供種蛋，自行孵化；H9亞型AI HA抗原和HI特異性抗體購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；One Step RT-PCR Kit、pMD18-T載體、α-2，3唾液酸酶和DNA Marker購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒、DNA純化/回收試劑盒購和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；1%綿羊紅細胞和1%雞紅細胞由病毒學(xué)國家重點實驗室自行制備，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 病毒分離純化及鑒定

將具有明顯病變的肺臟和支氣管病料樣品按比例加入生理鹽水進行研磨，反復(fù)凍融3次后8000 r/min離心5 min，取其上清液用0.22 μm一次性濾器進行過濾。采用尿囊腔接種方式將上清液接種至9日齡SPF雞胚中，37 ℃孵育觀察96 h，收集死亡和未死亡雞胚的尿囊液，分別以血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）鑒定病毒增殖效果。其中，HI試驗結(jié)果呈陽性的樣品參照仇保豐等（2010）的方法，通過有限稀釋法進行連續(xù)3輪的克隆純化，純化后的樣品增殖培養(yǎng)并超速離心后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 基因組RT-PCR擴增及測序

使用RNA提取試劑盒提取雞胚尿囊液中的病毒基因組RNA，同時參照Hoffmann等（2001）的方法合成擴增引物，并按照One Step RT-PCR Kit試劑盒說明采用一步法擴增病毒基因組的8個基因片段；所得PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)擴大培養(yǎng)后挑取單個菌落進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果呈陽性的菌液送至深圳華大基因公司進行測序。

1. 4 基因組遺傳進化分析

應(yīng)用DNASTAR對各基因片段的測序結(jié)果進行比對分析，將整理后正確的核苷酸序列以MEGA 7.0中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree繪制遺傳進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系。

1. 5 AIV受體結(jié)合特性測定

采用紅細胞法測定AIV受體結(jié)合特性（屈亞錦等，2013），即采用經(jīng)α-2，3唾液酸酶處理的1%雞紅細胞、1%綿羊紅細胞及1%雞紅細胞分別對待測病毒進行HA試驗，然后根據(jù)待測病毒與上述不同紅細胞結(jié)合特性的差異判定其受體親和性及是否存在感染人類的潛在可能性。

1. 6 病毒感染性試驗

將30羽4周齡的健康非免疫雞隨機平均分成兩組，其中一組作為空白對照組，另一組為感染組，即將AIV分離株雞胚尿囊液稀釋至106 EID50/100 μL，經(jīng)靜脈注射感染試驗雞（100 μL/羽）。病毒感染后連續(xù)觀察記錄試驗雞的臨床癥狀，并分別于攻毒后第1、3、5、7、9、11和14 d采集對照組和感染組試驗雞的咽喉和泄殖腔棉拭子進行病毒分離，檢測病毒感染試驗雞后的排毒情況；同時在攻毒后第3 d每組隨機剖檢3羽試驗雞，采集其氣管、肺臟、心臟、脾臟、盲腸扁桃體、腎臟和肝臟等器官組織進行病毒滴定試驗。攻毒后第14 d剖殺所有存活試驗雞并剖檢觀察其病變，然后綜合上述試驗結(jié)果評價該病毒分離株對雞的致病性及病毒的復(fù)制和排毒情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病毒分離及HA亞型血清學(xué)鑒定結(jié)果

利用SPF雞胚進行病毒分離，并對HA效價≥5log2的雞胚尿囊液進行HI試驗，其血清學(xué)鑒定結(jié)果表明分離獲得一株抗H9陽性血清且HI效價為6log2的AIV。

2. 2 病毒純化結(jié)果

采用有限稀釋法對AIV分離株進行克隆純化，通過連續(xù)3代的純化得到抗H9陽性血清且HI效價為9log2的毒株。將第4代雞胚尿囊液以低速離心機離心后取上清液再進行超速離心（40000 r/min離心4 h），棄上清液，其沉淀用1 mL滅菌生理鹽水懸浮后保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 3 病毒全基因RT-PCR擴增及測序結(jié)果

分離毒株經(jīng)RT-PCR擴增均可獲得與預(yù)期結(jié)果相符的8個目的基因條帶（圖1）。試劑盒回收各基因擴增目的片段，連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，進行擴大培養(yǎng)，將PCR鑒定呈陽性的菌液送至深圳華大基因公司進行測序，根據(jù)DNASTAR測序結(jié)果進行比對拼接，并登陸NCBI進行基因同源性BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA和NA基因測序結(jié)果與H9N2亞型AIV的核苷酸同源性最高，分別為99%和98%；其余6個內(nèi)部基因則與GenBank中其他AIV相應(yīng)基因核苷酸序列高度同源（表1）。綜合其血清學(xué)鑒定結(jié)果，將該分離毒株命名為A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）。

2. 4 基因組遺傳進化分析結(jié)果

分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）HA基因ORF為1683 bp，編碼560個氨基酸，與參考毒株（常見進化分支的代表性毒株）進行比對分析未發(fā)現(xiàn)有堿基插入或缺失。HA基因可被蛋白酶裂解成HA1和HA2兩個編碼區(qū)，分別編碼321和221個氨基酸，HA裂解位點為PSRSSR↓GLF，該特征為典型的LPAIV分子特征。HA受體結(jié)合位點的第226位（參照H3亞型編號）氨基酸如發(fā)生突變（Q→L），則表明該病毒對人流感病毒受體SAα-2，6的識別能力提高。分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）與越南分離毒株A/muscovy duck/Quang Ninh/132/2013（H9N6）的HA基因核苷酸同源性在99%以上，與目前國內(nèi)常用H9N2亞型AIV疫苗株的同源性卻在95%以下?；贖A基因核苷酸序列的遺傳進化分析結(jié)果也表明，分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）屬于4.2.5分支，與國內(nèi)常用H9N2亞型AIV疫苗株所處的4.2.3分支屬于不同小分支，存在一定差異（圖2）。分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）NA基因ORF為1401 bp，編碼466個氨基酸，與廣西分離毒株A/turtledove/Guangxi/49B6/2013（H9N2）的NA基因核苷酸同源性在98%以上，處在同一分支上（圖3）。其他6個內(nèi)部基因（PB1、PB2、PA、NP、M和NS）的編碼區(qū)長度分別為2274、2280、2151、1497、982和828 bp，依據(jù)其對應(yīng)的核苷酸序列分別構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）與廣西周邊地區(qū)和國家的分離毒株親緣關(guān)系密切，處于歐亞分支上，與北美分離毒株的親緣關(guān)系較遠且處在不同分支上。進一步的序列比對分析結(jié)果表明，這些內(nèi)部基因分別與H9N2、H7N9、H6N2和H10N8等亞型AIV相應(yīng)基因核苷酸序列存在較高的同源性，說明其內(nèi)部基因可能來源于上述參考毒株，也提示分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）的內(nèi)部基因來源關(guān)系較復(fù)雜。

2. 5 AIV受體結(jié)合特性分析結(jié)果

因含不同受體的AIV與不同動物紅細胞的結(jié)合能力也不同，故采用常規(guī)HA試驗測定其受體結(jié)合特性。以只含α-2，6唾液酸受體的綿羊紅細胞和經(jīng)α-2，3唾液酸處理的雞紅細胞分別與待測分離毒株進行HA試驗，結(jié)果表明，分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）與含有α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受體的紅細胞均能結(jié)合，但與含α-2，6唾液酸受體紅細胞的結(jié)合能力更強，說明該分離毒株同時具備與α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受體結(jié)合的特性，且具有感染人類的潛在風(fēng)險。

2. 6 病毒感染性試驗結(jié)果

感染組的15羽健康非免疫雞在攻毒后均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀和死亡情況，說明分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）屬于LPAIV。攻毒后第3 d剖檢，僅發(fā)現(xiàn)氣管充血并有少量黏液，腺胃內(nèi)黏液增多，其他臟器均未見明顯病變。各臟器病毒滴定結(jié)果表明，病毒分布主要集中在氣管、肺臟和脾臟（表2）。咽喉和泄殖腔棉拭子病毒檢測結(jié)果顯示，分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）可通過呼吸道和消化道同時排毒，且在攻毒后第1 d即開始排毒，第5 d為排毒高峰。

3 討論

本研究從廣西發(fā)病雞群中分離獲得一株H9亞型AIV[A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）]，其HA試驗結(jié)果顯示該分離毒株具有直接凝集雞紅細胞的特性，而HI試驗結(jié)果顯示該分離毒株只能被H9亞型AIV標準陽性血清所抑制，即血清學(xué)鑒定結(jié)果初步證實該分離毒株為H9亞型AIV。同時對分離毒株的8個基因進行克隆及測序分析，其中，HA基因核苷酸序列分析結(jié)果顯示HA裂解位點為PSRSSR↓GLF，具有典型LPAIV分子特征。張蔚和施一（2015）研究表明，HA受體結(jié)合位點的特異性決定了AIV感染的宿主范圍。本研究發(fā)現(xiàn)分離毒株HA基因的第226位受體結(jié)合位點發(fā)生突變（Q→L），表明分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）存在結(jié)合哺乳動物受體的可能性。AIV受體結(jié)合特性試驗結(jié)果顯示，分離毒株具備與α-2，6唾液酸受體結(jié)合的特性，與其氨基酸受體位點的分析結(jié)果相符。

H9N2亞型AIV是目前威脅我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要病毒之一，且其發(fā)病及繼發(fā)感染趨勢越來越嚴重，許多家禽養(yǎng)殖場即使免疫了H9亞型AIV疫苗也時有AIV暴發(fā)流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（顧敏等，2015；張小峰等，2016）。本研究中，基于HA基因核苷酸序列的遺傳進化分析結(jié)果表明，分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）屬于4.2.5分支，而目前國內(nèi)常用的H9N2亞型AIV疫苗株如SD696株、F株和SS株等在遺傳進化關(guān)系上均屬于4.2.3分支（叢彥龍等，2017），二者雖同屬于4.2大分支，但在遺傳進化關(guān)系上兩個小分支間存在明顯差異，而這些差異可能導(dǎo)致其抗原性與疫苗株不一致，使得當(dāng)前應(yīng)用的疫苗無法提供100%的保護率。此外，廣西毗鄰AI疫情復(fù)雜的越南，同時處于全球候鳥遷徙路線上，加上當(dāng)?shù)剞r(nóng)民普遍存在放養(yǎng)家禽的習(xí)慣，為AIV變異株的產(chǎn)生或新亞型的形成甚至流行創(chuàng)造了理想條件。本研究中，分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）與越南分離毒株A/muscovy duck/Quang Ninh/132/2013（H9N6）的HA基因核苷酸同源性在99%以上，推測其來源于越南的鴨子；其他6個內(nèi)部基因也分別來源于不同的AIV亞型，說明該分離毒株是一株由不同亞型AIV重組產(chǎn)生的新病毒。分離毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）屬于LPAIV，臨床中出現(xiàn)的呼吸道癥狀、支氣管栓塞及死亡情況可能是由其他病毒混合感染或繼發(fā)細菌感染所引起，但具體原因有待進一步探究證實。

4 結(jié)論

從廣西發(fā)病雞群中分離獲得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）屬于LPAIV，是由不同亞型AIV重組產(chǎn)生的H9N2亞型新毒株，可導(dǎo)致雞群疫苗免疫失敗，且具有感染人類的潛在風(fēng)險。

參考文獻：

陳伯倫，張澤紀，陳偉斌. 1994. 禽流感研究I. 雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J]. 中國獸醫(yī)雜志，20（10）：3-5. [Chen B L，Zhang Z J，Chen W B. 1994. Isolation and preliminary serological identification of avian influenza virus-type A from chickens[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine，20（10）：3-5.]

叢彥龍，鐘穎，孫藝學(xué)，丁壯. 2017. H9N2亞型禽流感病毒流行病學(xué)及其疫苗的研究進展[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，37（2）：386-392. [Cong Y L，Zhong Y，Sun Y X，Ding Z. 2017. Advance on epidemiology and vaccine of H9N2 avian influenza virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，37（2）：386-392.]

顧敏，彭大新，劉秀梵. 2015. 我國H9N2亞型禽流感病毒的流行和進化特點[J]. 生命科學(xué)，27（5）：531-538. [Gu M，Peng D X，Liu X F. 2015. Features of the evolution and epidemiology of H9N2 subtype avian influenza virus in China[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，27（5）：531-538.]

郭元吉，李建國，程小雯，王敏，鄒毅，李釧華，蔡訪潺，廖華樂，張燁，郭俊峰，黃瑞敏，貝東. 1999. 禽H9N2亞型流感病毒能感染人的發(fā)現(xiàn)[J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，13（2）：105-108. [Guo Y J，Li J G，Cheng X W，Wang M，Zou Y，Li C H，Cai F C，Liao L H， Zhang Y，Guo J F，Huang R M，Bei D. 1999. Discovery of men infected by avian influenza A（H9N2） virus[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology，13（2）：105-108.]

孟芳，徐懷英，張偉，黃迪海，張再輝，劉霞，常維山，秦卓明. 2016. 近20年中國部分地區(qū)雞源H9N2亞型禽流感病毒HA基因遺傳演化及其變異頻率[J]. 微生物學(xué)報， 56（1）：35-43. [Meng F，Xu H Y，Zhang W，Huang D H，Zhang Z H，Liu X，Chang W S，Qin Z M. 2016. Genetic evolution and substitution frequency of avian influenza virus HA gene in chicken H9N2 subtype in China in the last 20 years[J]. Acta Microbiologica Sinica，56（1）：35-43.]

仇保豐，劉武杰，胡順林，唐應(yīng)華，彭大新，劉秀梵. 2010. 混合感染的多種亞型禽流感病毒的純化與鑒定[J]. 微生物學(xué)報，50（1）：107-112. [Qiu B F，Liu W J，Hu S L，Tang Y H，Peng D X，Liu X F. 2010. Purification and identification of avian influenza viruses causing mixed multi-infection[J]. Acta Microbiologica Sinica，50（1）：107-112.]

屈素潔，施開創(chuàng)，鄒聯(lián)斌，胡杰，張步嫻，粟艷瓊，梁媛，尹彥文，李軍，莫勝蘭. 2016.2011～2014年廣西H9N2亞型禽流感病毒HA基因遺傳變異分析[J]. 畜牧與獸醫(yī)，48（3）：16-20. [Qu S U，Shi K C，Zou L B，Hu J，Zhang B X，Su Y Q，Liang Y，Yin Y W，Li J，Mo S L. 2016. Phylogenetic analysis of HA genes of H9N2 subtype avian influenza virus in Guangxi from 2011 to 2014[J]. Animal Husban-dry & Veterinary Medicine，48（3）：16-20.]

屈亞錦，屈秋錦，李超，劉月月，石迎，劉立濤，任慶海，劉思當(dāng). 2013. 2011年中國北方H9N2亞型禽流感病毒分離株HA基因進化分析及受體結(jié)合性檢測[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，35（10）：787-790. [Qu Y J，Qu Q J，Li C，Liu Y Y，Shi Y，Liu L T，Ren Q H，Liu S D. 2013. Phylogenetic analysis of the hemagglutinin genes and detection of receptor binding specificity of H9N2 influenza viruses isolated from Northern China[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，35（10）：787-790.]

譚偉，謝芝勛. 2014. 甲型流感病毒NS1、NS2和NS3蛋白的研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，45（12）：1911-1916. [Tan W，Xie Z X. 2014. An overview of research progress on NS1，NS2 and NS3 proteins of influenza a viruses[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，45（12）：1911-1916.]

王愛榮. 2015. H9N2亞型AIV受體結(jié)合特性分析及內(nèi)部基因?qū)χ虏⌒杂绊懙难芯縖D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wang A R. 2015. Receptor binding characterization of H9N2 AIV and the relation of internal gene segments with virulence in mouse[D]. Taian：Shandong Agricultural University.]

王秀榮，陳化蘭. 2015. 流感病毒對人類和畜牧業(yè)健康的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（15）：3038-3039. [Wang X R，Chen H L. 2015. The impact of influenza viruses on human and animal husbandry[J]. Scientia Agricultura Sinica，48（15）：3038-3039.]

韋平，秦愛建. 2008. 重要動物病毒分子生物學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社：3-27. [Wei P，Qin A J. 2008. Molecular Biology of Important Animals[M]. Beijing：Science Press：3-27.]

魏寶之. 2013. H9N2亞型AIV山東分離株全基因序列分析及其在豚鼠間的傳播[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wei B Z. 2013. Whole genome sequence analysis and experimental transmission in guinea pigs of H9N2 avian influenza viruses isolated from Shandong[D]. Taian：Shandong Agricultural University.]

吳青，李銀，李祥瑞，趙冬敏，劉青濤，劉宇卓，韓凱凱，黃欣梅. 2017. 江蘇H9N2亞型禽流感病毒HA和NA的遺傳進化分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，29（7）：104-109. [Wu Q，Li Y，Li X R，Zhao D M，Liu Q T，Liu Y Z，Han K K，Huang X M. 2017. Genetic evolution analysis of H9N2-subtype avian influenza viruses HA and NA in Jiangsu Province[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，29（7）：104-109.]

謝芝勛，董建寶，唐小飛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤. 2007. 3株H9N2亞型禽流感病毒廣西分離株全基因組序列的測定與分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，23（9）：916-924. [Xie Z X，Dong J B，Tang X F，Liu J B，Pang Y S，Deng X W，Xie Z Q. 2007. Whole genome sequencing and analysis of three strains of avian influenza virus subtype H9N2 isolated in Guangxi Province[J]. Chinese Journal of Zoonoses，23（9）：916-924.]

楊均，王開功，汪德生，朱永毅，楊敬，潘明興，顏德林，劉長寧. 2016. 貴州H9N2亞型禽流感病毒NA基因的遺傳演化特征[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（6）：108-111. [Yang J，Wang K G，Wang D S，Zhu Y Y，Yang J，Pan M X，Yan D L，Liu C N. 2016. Genetic evolution characteristics of NA gene of H9N2 subtype AIV from GZ01 strain[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（6）：108-111.]

張靜，陳立根，張宇，孫乾晉，李如意，白牧原，藺文成，謝青梅. 2016. 1997～2015年我國不同地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒流行情況研究[J]. 中國家禽，38（20）：20-27. [Zhang J，Chen L G，Zhang Y，Sun Q J，Li R Y，Bai M Y，Lin W C，Xie Q M. 2016. Prevalence of H9N2 subtype avian influenza virus in different regions of China during 1997 to 2015[J]. China Poultry，38（20）：20-27.]

張蔚，施一. 2015. 禽流感病毒跨種傳播的分子機制[J]. 生命科學(xué)，27（5）：539-548. [Zhang W，Shi Y. 2015. Molecular mechanisms on interspecies transmission of avian influenza viruses[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，27（5）：539-548.]

張小峰，吳曉嬋，何柳芬，鐘植文. 2016. 廣東珠三角地區(qū)H9亞型禽流感病毒HD株的分離鑒定[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治，（6）：6-10. [Zhang X F，Wu X C，He L F，Zhong Z W. 2016. Identification and isolation of H9 subtype avian influenza virus HD strain in pearl river delta region of Guangdong [J]. Poultry Husbandry and Disease Control，（6）：6-10.]

Chen H，Yuan H，Gao R，Zhang J，Wang D，Xiong Y，F(xiàn)an G，Yang F，Li X，Zhou J，Zou S，Yang L，Chen T，Dong L，Bo H，Zhao X，Zhang Y，Lan Y，Bai T，Dong J，Li Q，Wang S，Zhang Y，Li H，Gong T，Shi Y，Ni X，Li J，Zhou J，F(xiàn)an J，Wu J，Zhou X，Hu M，Wan J，Yang W，Li D，Wu G，F(xiàn)eng Z，Gao G F，Wang Y，Jin Q，Liu M，Shu Y. 2014. Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian influenza A H10N8 virus infection：A descriptive study[J]. Lancet，383（9918）：714-721.

Hoffmann E，Stech J，Guan Y，Webster R G，Perez D R. 2001. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Archives of Virology，146（12）：2275-2289.

Liu D，Shi W，Gao G F. 2014. Poultry carrying H9N2 act as incubators for novel human avian influenza viruses[J]. Lancet，383（9920）：869.

Liu D，Shi W，Shi Y，Wang D，Xiao H，Li W，Bi Y，Wu Y，Li X，Yan J，Liu W，Zhao G，Yang W，Wang Y，Ma J，Shu Y，Lei F，Gao G F. 2013. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：Phylogenetic，structural，and coalescent analyses[J]. Lancet，381（9881）：1926-1932.

Pan Y，Cui S，Sun Y，Zhang X，Ma C，Shi W，Peng X，Lu G，Zhang D，Liu Y，Wu S，Yang P，Wang Q. 2017. Human infection with H9N2 avian influenza in Northern China[J]. Clinical Microbiology and Infection，24（3）：321-323.

Peiris M，Yuen K Y，Leung C W，Chan K H，Ip P L，Lai R W，Orr W K，Shortridge K F. 1999. Human infection with influenza H9N2[J]. Lancet，354（9182）：916-917.

Tong S，Zhu X，Li Y，Shi M，Zhang J，Bourgeois M，Yang H，Chen X F，Recuenco S，Gomez J，Chen L M，Johnson A，Tao Y，Dreyfus C，Yu W L，McBride R，Carney P J，Gilbert A T，Chang J，Guo Z，Davis C T，Paulson J C，Stevens J， Rupprecht C E，Holmes E C，Wilson I A，Donis R O. 2013. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLoS Pathogens，9（10）：e1003657.

Wei Y，Xu G，Zhang G，Wen C，Anwar F，Wang S，Lemmon G，Wang J，Carter R，Wang M，Sun H，Sun Y，Zhao J，Wu G，Webster R G，Liu J，Pu J. 2016. Antigenic evolution of H9N2 chicken influenza viruses isolated in China du-ring 2009-2013 and selection of a candidate vaccine strain with broad cross-reactivity[J]. Veterinary Microbiology，182：1-7.

Xu W，Li X，Bai T，Zhao X，Zhao X，Zhang Y，Guo J，Li Z，Yang L，Wang D，Shu Y. 2016. A fatal case of infection with a further reassortant，highly pathogenic avian influen-za（HPAI） H5N6 virus in Yunnan， China[J]. Infection，Genetics and Evolution，40：63-66.

Zhu X，Yu W，McBride R，Li Y，Chen L M，Donis R O，Tong S X，Paulson J C，Wilson I A. 2013. Hemagglutinin homo-loge from H17N10 bat influenza virus exhibits divergent receptor-binding and pH-dependent fusion activities[J]. P-

roceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America，110（4）：1458-1463.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）