謝芳 吳官保 姚紅艷 馮帥華 楊屆

〔摘要〕 目的 觀察補(bǔ)腎活血湯對(duì)衰老大鼠退變椎間盤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及β-catenin蛋白含量的影響。方法 選取三月齡健康SD大鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、假模型組、模型組、中藥低劑量組以及中藥高劑量組，每組16只，雌雄各半。除空白組和假模型組外，其余各組注射D-半乳糖建立大鼠衰老動(dòng)物模型，空白對(duì)照組、假模型組與模型組每日生理鹽水灌胃，中藥低劑量組及中藥高劑量組補(bǔ)腎活血湯每日灌胃，持續(xù)12周。分別于造模后、灌胃4周后、灌胃8周后、灌胃12周后每組隨機(jī)抽取雌雄大鼠各2只處死取材，光鏡下觀察椎間盤組織形態(tài)學(xué)變化并運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)差異。結(jié)果 與模型組比較，經(jīng)補(bǔ)腎活血湯干預(yù)后，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠椎間盤組織形態(tài)學(xué)評(píng)分降低（P<0.05），β-catenin蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)腎活血湯能有效抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白分子β-catenin蛋白的表達(dá)，從而起到延緩椎間盤退變的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)腎活血湯；腰椎間盤退變；β-catenin蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R681.5+3 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.011

Effects of Bushen Huoxue Decoction on β-catenin Protein Level of WNT Signal Pathway in Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Aging Model Rats

XIE Fang1， WU Guanbao1*， YAO Hongyan2， FENG Shuaihua1， YANG Jie1

（1. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China； 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Bushen Huoxue decoction on the structural and histopathological changes and β-catenin protein in lumbar intervertebral disc degeneration aging model rats. Methods Eighty three-month old SD rats （male-female half and half） were randomly divided into blank control group， sham-model group， model group， TCM low-dose group and TCM high-dose group， 16 rats in each group. Except the blank group and sham-model group， the aging model rats in other groups were established by injecting D-galactose. The rats in blank control group，sham-model group and model group were daily given normal saline by gavage. TCM low-dose and high-dose groups were daily treated with Bushen Huoxue decoction for 12 weeks by gavage. Two male rats and two female rats in each group were randomly executed at after modelling， after 4 weeks of gavage， after 8 weeks of gavage and after 12 weeks of gavage， and samples were selected from dead rats. The histomorphological change of model group was observed by light microscope， and the expression of β-catenin protein was detected by Western Blot method. Results Compared with the model group， the histomorphology score in TCM low-dose and high-dose groups treated with Bushen Huoxue decoction decreased （P<0.05）， and the expression of β-catenin protein decreased （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction shows inhibition effect on the expression of key β-catenin protein in the classical Wnt/β-catenin signal pathway， and thus could relieve the degeneration of intervertebral disc.

〔Keywords〕 Bushen Huoxue decoction； lumbar intervertebral disc degeneration； β-catenin protein

腰椎退行性病變及腰椎間盤突出癥作為臨床常見病癥，給現(xiàn)代人們的生活造成的困擾正日漸加重。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，人們生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病日益趨向年輕化和嚴(yán)重化[1]。目前椎間盤的具體退變機(jī)制尚未明確，近年來對(duì)其退變信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的研究已成為一大熱點(diǎn)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包含多種分支傳導(dǎo)信號(hào)通路，其中每一條亞通路都有其特定的作用。目前逐漸被研究人員所熟悉的主要是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。研究表明[2]，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活能改變椎間盤組織細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)軟骨終板、髓核及纖維環(huán)的退變，從而引起椎間盤結(jié)構(gòu)的變形。本項(xiàng)目前期研究[3-4]證明：補(bǔ)腎活血湯在通過減少椎間盤組織中炎性因子的表達(dá)，減少炎性反應(yīng)從而有效緩解椎間盤的退變。本文旨在通過觀察D-半乳糖致衰老大鼠椎間盤的退變情況，并檢測(cè)β-catenin蛋白在退變椎間盤治療前后的表達(dá)情況研究補(bǔ)腎活血湯對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的影響，從另一個(gè)角度揭示補(bǔ)腎活血湯對(duì)于椎間盤退變的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 三月齡SD大鼠（SPF級(jí)）80只，雌雄各半，體質(zhì)量（236.40±54.28） g，生產(chǎn)單位：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，動(dòng)物合格證編號(hào)：43004700027559。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 D-半乳糖（批號(hào)：H15M8C30836）：上海源葉生物科技有限公司，純度99%；Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅：美國(guó)Sigma公司；HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG：美國(guó)Proteintech；RIPA裂解液：中國(guó)北京普利萊公司；蛋白酶抑制劑：德國(guó)Merck公司；蛋白磷酸酶抑制劑：瑞士Roche公司；SuperECL Plus超敏發(fā)光液：美國(guó)Thermo pierce公司；顯影液、定影液：中國(guó)WellBiology公司（以上試劑均由維爾生物科技有限公司統(tǒng)一采供并提供）。

1.1.3 補(bǔ)腎活血湯制備 按《傷科大成》中所載方劑補(bǔ)腎活血湯，以現(xiàn)在臨床常用藥物劑量為依準(zhǔn)，處方組成：熟地黃15 g，杜仲10 g，枸杞子10 g，補(bǔ)骨脂15 g，菟絲子10 g，當(dāng)歸尾10 g，沒藥10 g，山茱萸10 g，紅花6 g，獨(dú)活10 g，肉蓯蓉10 g，上述飲片均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供。浸泡、煎煮、去渣，分別濃縮至生藥含量約為0.58 g/mL及1.66 g/mL 2種劑量（分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1、2倍），封瓶備用。

1.1.4 主要儀器 TS-92型搖床（江蘇其林貝爾有限公司）；TGL-18R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（深圳黑馬有限公司）；164-5050型電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司）；DYCZ-24EN型電泳槽（北京六一有限公司）；DYCZ-40A型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一有限公司）；QL-901型旋渦混合器（江蘇其林貝爾有限公司）（以上均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院病理科提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 80只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為5組，A組為空白組16只，B組為假模型組16只（注射生理鹽水），C組為衰老模型組（D-半乳糖干預(yù)）16只，D組為中藥低劑量組16只、E組為中藥高劑量組16只（均為補(bǔ)腎活血湯干預(yù)）。

1.2.2 動(dòng)物造模 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法借鑒邱柏程等[5]衰老大鼠模型造模方法：A組大鼠不予以處理用作空白對(duì)照，C組、D組、E組大鼠分別予以10%D-半乳糖溶液0.125 g/（kg·d）腹腔注射，B組大鼠予以等量生理鹽水腹腔注射，藥物注射造模時(shí)間為30 d，造模期間每只大鼠每日腹腔注射前，先稱量質(zhì)量，根據(jù)大鼠質(zhì)量變化調(diào)整注射劑量。造模后各組隨機(jī)選取雌雄大鼠各2只，處死后取出腰椎間盤組織，制作石蠟標(biāo)本，在光鏡下觀察各組大鼠椎間盤形態(tài)。按Miyamoto等[6]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將椎間盤組織在光鏡下的觀察結(jié)果分為1-5級(jí)，分別規(guī)定為1、2、3、4、5分，椎間盤形態(tài)達(dá)3級(jí)或以上為造模成功。

1.2.3 干預(yù)方法 大鼠造模成功后，根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式，計(jì)算出大鼠給藥劑量。A、B、C組均予以生理鹽水灌胃，D組、E組分別以5.8 g/kg、16.6 g/kg灌胃予以補(bǔ)腎活血湯，每天1次，灌胃期間每周稱1次大鼠質(zhì)量，根據(jù)質(zhì)量變化調(diào)整藥物灌胃劑量，持續(xù)12周。

1.2.4 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)過程中分別于造模后、灌胃4周后、灌胃8周后、灌胃12周后于各組隨機(jī)抽取雌雄大鼠各2只，處死后取出腰椎間盤組織，一部分制作成蠟塊標(biāo)本，于光學(xué)顯微鏡下觀察椎間盤形態(tài)結(jié)構(gòu)，另一部分取出的椎間組織盤測(cè)定質(zhì)量后冷凍，用于測(cè)定β-catenin 蛋白的含量。

1.2.5 光鏡下觀察椎間盤形態(tài)組織變化及評(píng)分 分別于造模后、灌胃第4周、第8周、第12周時(shí)取各組玻片標(biāo)本于光鏡下觀察椎間盤組織的形態(tài)組織變化，依據(jù)Wang等[7]制定的椎間盤評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)：以光鏡下大鼠椎間盤纖維環(huán)、髓核、骨贅3個(gè)觀察因子（每個(gè)觀察因子按退變情況從低到高分別計(jì)為0～3分）為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分，最后根據(jù)總分評(píng)價(jià)椎間盤的退變情況。

1.2.6 β-catenin蛋白含量測(cè)定 采用Western blot方法，根據(jù)BCA方法測(cè)定β-catenin蛋白濃度。將樣品制備后，通過BCA蛋白定量試劑盒（WellBiology），測(cè)定β-catenin濃度范圍（操作按試劑盒指示說明依次操作），作為Western blot的參考。電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜110 min，25 ℃用5%脫脂奶粉封閉1 h。稀釋一抗，4 ℃過夜，β-catenin稀釋比例為1∶1 000，β-actin稀釋比例為1∶4 000，HRP標(biāo)識(shí)的二抗以1：3 000的比例混合稀釋，室溫下孵育45～60 min。ECL化學(xué)發(fā)光液（Thermo）與膜一起孵育3 min后，與X膠片在暗盒內(nèi)片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘；顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，以β-catenin蛋白條帶灰度與β-actin蛋白條帶灰度的比值表示β-catenin蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示。使用單因素的方差分析對(duì)比各組間的均數(shù)，如果滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析的最小二乘法（LSD法），行多組間均數(shù)的兩兩比較，方差不齊時(shí)，采用t檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)表示各組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組大鼠椎間盤組織形態(tài)變化

造模后，A、B組纖維環(huán)及髓核結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)律；C、D、E組纖維環(huán)膠原纖維層及軟骨排列雜亂，髓核皺縮（見圖1）。灌胃4周后，A、B組椎間盤組織無明顯變化；C組纖維層變薄，軟骨細(xì)胞增多；D、E組纖維層變薄，無軟骨細(xì)胞增生。灌胃8周后，A、B組膠原纖維及軟骨細(xì)胞分層排列，髓核稍有脫水；C組纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙，軟骨層鈣鹽沉積；D組纖維層逐漸被軟骨細(xì)胞取代；E組纖維層維持排列。灌胃12周后，A、B組纖維層變薄，不規(guī)則排列；C組原纖維層骨化物生成，膠原纖維及髓核基本消失；D組鈣鹽沉積；E組纖維環(huán)破裂（見圖2）。

2.2 各組大鼠椎間盤形態(tài)組織學(xué)評(píng)分

造模后，與空白組、假模型組對(duì)比，所有D-半乳糖致衰老大鼠椎間盤形態(tài)組織學(xué)評(píng)分均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明衰老大鼠椎間盤退變，提示造模成功；灌胃4、8、12周后，與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠椎間盤形態(tài)組織學(xué)評(píng)分降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示補(bǔ)腎活血湯能有效延緩大鼠椎間盤的退變。結(jié)果見表1。

2.3 各組大鼠β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

造模后：與空白組對(duì)比，假模型組β-catenin蛋白表達(dá)水平無明顯差異；與空白組對(duì)比，模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組中β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明造模成功，即D-半乳糖能加速大鼠椎間盤退變。灌胃4、8、12周后：與空白組對(duì)比，模型組中β-catenin蛋白表達(dá)水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明D-半乳糖能加速大鼠椎間盤退變；與模型組對(duì)比，中藥低劑量組、中藥高劑量組中β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明補(bǔ)腎活血湯能減少大鼠椎間盤內(nèi)β-catenin蛋白的含量，即能延緩大鼠椎間盤的退變；與中藥低劑量組對(duì)比，中藥高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明高濃度補(bǔ)腎活血湯對(duì)大鼠椎間盤退變的治療效果更好，進(jìn)一步證明補(bǔ)腎活血湯對(duì)椎間盤退變的治療意義。見表2、圖3-圖7。

3 討論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要分支，是由β-catenin蛋白介導(dǎo)的，對(duì)細(xì)胞的增殖代謝及生長(zhǎng)發(fā)育有著重要意義的調(diào)控系統(tǒng)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路由Wnt配體，跨膜受體，β-catenin蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等組成。在靜息狀態(tài)下，β-catenin蛋白被細(xì)胞質(zhì)中的降解復(fù)合體不斷的磷酸化，處于低濃度表達(dá)水平；Wnt配體與跨膜受體結(jié)合后，將β-catenin蛋白從降解復(fù)合體中游離出來，使其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平增高，最終β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，并激活下游的轉(zhuǎn)錄因子。通常認(rèn)為β-catenin蛋白表達(dá)水平的增高是Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的標(biāo)志。目前較多的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠調(diào)控軟骨細(xì)胞的生存與代謝[8-10]。椎間盤組織作為一個(gè)類軟骨組織其軟骨終板的退變與鈣化正是椎間盤退變的表現(xiàn)形式之一，所以Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與椎間盤的退化有著必然的聯(lián)系。Hiyama等[11]通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，檢測(cè)到椎間盤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平增高。因MMPs能夠降解椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維及蛋白多糖從而加快椎間盤的退變速度，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平，從而參與到椎間盤的退變過程之中。

在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的認(rèn)知中椎間盤退變性疾病屬于“痹癥”的范疇，常因風(fēng)邪夾濕氣或寒邪侵襲人體所致。《靈樞·百病始生》記載：“風(fēng)雨寒熱，不得虛，邪不能獨(dú)傷人?！备啐g人群因?yàn)槟旮唧w衰，肝腎不足，致使肝腎之精不能濡養(yǎng)筋骨，從而出現(xiàn)腰部疼痛，下肢酸軟等癥狀。腰為腎之府，腎為先天之本，藏精主骨，為一身陰陽(yáng)之根本；肝在體合筋，肝血充足則筋肉強(qiáng)勁有力，肢體活動(dòng)自如。肝腎虧虛，不能滋養(yǎng)筋骨，筋骨萎弱，氣行不暢，邪氣入侵腰部，致使腰部長(zhǎng)期疼痛不愈。所以本病之本為肝腎虧虛，其標(biāo)為風(fēng)寒濕邪、血瘀氣滯、痰飲等[12]。趙永華等[13]認(rèn)為腰椎間盤突出的發(fā)病“腎虛”為本，“瘀血”為標(biāo)，運(yùn)用補(bǔ)腎活血針法能有效的緩解腰部疼痛?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[14]補(bǔ)腎活血湯能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增值，并能降低炎性因子的表達(dá)。補(bǔ)腎活血湯為我國(guó)清代醫(yī)家趙濂所著《傷科大成》所記載的經(jīng)方，方中熟地黃、山茱萸為君藥，益腎填精；杜仲、枸杞、肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂、菟絲子為臣藥，溫補(bǔ)元陽(yáng)，使筋骨堅(jiān)強(qiáng)；當(dāng)歸尾、沒藥、紅花、獨(dú)活為佐藥，活血通絡(luò)，祛風(fēng)除濕。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，以補(bǔ)腎溫陽(yáng)為主，兼以活血祛濕，扶正祛邪，標(biāo)本兼顧。

本次實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)D-半乳糖連續(xù)注射后的大鼠椎間盤組織中的β-catenin水平，發(fā)現(xiàn)模型組中β-catenin蛋白的表達(dá)水平明顯較空白組高（P<0.05），證明Wnt/β-catenin信號(hào)通路確實(shí)參與到椎間盤的退變過程中，提示W(wǎng)nt/β-catenin的異常激活能加速椎間盤的退變。通過分別檢測(cè)補(bǔ)腎活血湯灌胃4、8、12周后大鼠椎間盤組織中β-catenin表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)中藥低劑量組與中藥組高劑量組中β-catenin蛋白的表達(dá)水平明顯較模型組低（P<0.05），表明經(jīng)過補(bǔ)腎活血湯干預(yù)，β-catenin蛋白在椎間盤組織細(xì)胞中的表達(dá)水平下調(diào)，補(bǔ)腎活血湯能夠通過調(diào)控β-catenin蛋白的表達(dá)從而起到延緩椎間盤退變的治療效果。綜上所述，補(bǔ)腎活血湯能有效地降低退變椎間盤中β-catenin蛋白的表達(dá)，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，能有效地延緩椎間盤的退變。

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