滕杰 曾貞 黃亞輝

摘 要：該研究采用分光光度法和高效液相色譜法，分不同葉位對禿房茶（Camellia gymnogyna）的嘌呤生物堿組成特點以及茶多酚、兒茶素組分、游離氨基酸、黃酮、茶氨酸等生化品質(zhì)成分進行了測定。結(jié)果表明：禿房茶的嘌呤生物堿組成及配比顯著區(qū)別于茶葉植物鳳凰單從（C. sinensis），同時具有可可堿、咖啡堿和苦茶堿三種組分，而且可可堿含量最多，為13.46～39.72 mg·g-1，咖啡堿含量最低，為0.51～2.02 mg·g-1，苦茶堿含量介于兩者中間并隨芽葉成熟度增加而升高。茶葉植物只存在咖啡堿和可可堿，含量變化分別為22.22～53.13 mg·g-1和0.47～12.82 mg·g-1。在相同葉位中，禿房茶兒茶素組分含量變化規(guī)律為EGCG>C>ECG>EGC>EC>GC>CG>GCG，且兒茶素總量、酯型兒茶素含量均低于茶葉植物，而非酯型兒茶素總量接近，保持為40～50 mg·g-1。除黃酮含量在各葉位變化趨勢不大外，其他品質(zhì)成分含量變化基本符合第1葉>芽>第2葉>第3葉>第4葉，一芽二葉的含量介于第1葉和第2葉之間的規(guī)律，而茶多酚、黃酮、茶氨酸等其它品質(zhì)成分含量均低于茶葉植物。該研究首次明確了禿房茶主要生化品質(zhì)成分變化規(guī)律，特別是嘌呤生物堿的組成及配比特點，且含有特征性成分—苦茶堿。該研究結(jié)果為生物堿代謝機理、特異茶加工、功能成分開發(fā)、低咖啡堿資源、選育種等提供了優(yōu)良材料。

關(guān)鍵詞：禿房茶，苦茶堿，HPLC，生物堿，兒茶素

中圖分類號：Q946.88，S571.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）05-0568-09

Abstract：In order to investigate components of purine alkaloids and contents of tea polyphenols，catechins，free amino acids，flavonoids and theanine （Thea） in different leaf positions of Camellia gymnogyna were studied by the methods of ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography （HPLC）. The results showed that the component of purine alkaloids，consisted of caffeine （Caf），theobromine （Tb） and theacrine （Tc），had significant differences between the C. sinensis and C. gymnogyna. Tb content was the highest，reached 13.46-39.72 mg·g-1，Caf content was the lowest，only kept 0.51-2.02 mg·g-1，and the content of Tc increased with leaves maturing. However， C. sinensis only contained caffeine and theobromine，whose contents respectively varied from 22.22 to 53.13 mg·g-1，0.47 to 12.82 mg·g-1. In the same tea leaf position，catechins component of C. gymnogyna were as follows：EGCG>C>ECG>EGC>EC>GC>CG>GCG，and the total amount of catechins，ester-catechins were significantly lower than C. sinensis，while none-ester catechins content was almost the same，kept 40-50 mg·g-1. The content of flavonoids demonstrated almost same in different leaf positions while other biochemical components content were as follows：the 1st leaf > bud > the 2nd leaf > the 3rd leaf > the 4th leaf，and the contents of one bud and two leaves were between the 1st leaf and the 2nd leaf content； while tea polyphenols，flavonoids，theanine and other quality components were lower than those of C. sinensis. This study clarified the changes of the main biochemical quality components of the C. gymnogyna for the first time，especially the composition and proportion of purine alkaloids，which contained the characteristic ingredient-theacrine. The research could be served as important and valuable tea tree resources，and application in alkaloid metabolism mechanism，special tea processing，functional ingredients，low caffeine resources and genetic breeding.

Key words：Camellia gymnogyna，theacrine，HPLC，alkaloid，catechin

茶樹鮮葉中主要生化成分的含量和比例是鑒別茶樹種質(zhì)資源、茶樹選育種、決定茶類適制性和茶葉綜合利用價值的物質(zhì)基礎(chǔ)，在大量茶樹資源中不乏優(yōu)質(zhì)和特異資源，可直接用于茶葉加工或資源創(chuàng)新 （段學(xué)藝等，2012）。茶含有多種功能性物質(zhì)，是健康之飲集中體現(xiàn) （Hayat et al，2015；Ryu et al，2017），最常見的茶多酚是一類存在于茶葉中的多元酚混合物，主要由兒茶素、花青素與花白素類、酚酸及縮酚酸類、黃酮及黃烷醇類組成，占干茶重的18%～36% （Xiao et al，2007），它與茶葉品質(zhì)及適制性密切相關(guān)，是綠茶滋味濃度和苦澀味的代表物質(zhì)，是紅茶色、香、味等品質(zhì)的關(guān)鍵因素，是茶品濃度的物質(zhì)基礎(chǔ)（刁春英和高秀瑞，2016）。氨基酸是呈現(xiàn)茶葉鮮爽味的主要物質(zhì)，不僅與茶葉香氣的形成有關(guān)，還影響茶湯的滋味和色澤 （曲映紅和王建中，2016）。酚氨比值大小可以作為茶樹鮮葉適制性的另一指標(biāo)（楊興榮等，2016）。茶氨酸作為茶葉的特征性氨基酸，屬于谷氨酰胺類化合物，占茶葉干重的 1%～2%，具有調(diào)節(jié)免疫、增強記憶、安神鎮(zhèn)靜等多種生物活性，被譽為“天然鎮(zhèn)靜劑”（Tai et al，2015；郭晨等，2017）。嘌呤生物堿作為茶樹的主要次生代謝產(chǎn)物之一，主要包括咖啡堿、可可堿、茶葉堿、苦茶堿（屬于甲基尿酸）等 （金基強等，2014）。生物堿是茶葉風(fēng)味的主要生化物質(zhì)之一，同時也是重要的功能成分。由于氧化及甲基化等生物代謝作用影響，不同種類的嘌呤取決于嘌呤環(huán)上的甲基位置和個數(shù)的不同（Ashihara et al，2008）。

植物形態(tài)表型性狀是種質(zhì)資源的重要特征，生化成分和抗性性狀是種質(zhì)資源的物質(zhì)基礎(chǔ) （喬小燕等，2015），而茶樹種質(zhì)資源是品種創(chuàng)新、茶葉品質(zhì)提升和開發(fā)新產(chǎn)品的物質(zhì)保障。結(jié)合國內(nèi)外茶組植物分類研究，通常將茶組植物分為大廠茶 （Camellia tachangensis）、禿房茶 （C. gymnogyna）、厚軸茶 （C. crassicolumna）、大理茶 （C. taliensis）和茶 （C. sinensis）等5種，此外，在茶下又分茶 （C. sinensis var. sinensis）、普洱茶 （C. sinensis var. assamica、白毛茶 （C. sinensis var. pubilimba） 等 3 變種的分類系統(tǒng)。野生茶樹主要屬于大廠茶、禿房茶、厚軸茶、大理茶，個別屬于茶，栽培型茶樹主要屬于茶種及普洱茶、 白毛茶等變種（陳亮，1996；陳玲，2000；陳亮等，2000；龔萬灼和張澤岑，2006）。

金秀瑤族自治縣位于廣西壯族自治區(qū)中部偏東的大瑤山主體山脈上，整個山體呈東北向西南走向，總面積2 518 km2，山脊平均海拔1 200 m。我們研究團隊自2012年開始就對金秀縣境內(nèi)野生茶資源、種類、生物性狀、遺傳進化和品質(zhì)成分進行系統(tǒng)研究，在調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)除茶種以外，還有厚軸茶、禿房茶等群體（黃亞輝等，2014，2015）。該文以廣西金秀縣大瑤山發(fā)現(xiàn)的禿房茶為實驗材料，采用液相色譜法、紫外分光光度法測定其生物堿組成特點和生化品質(zhì)成分含量變化。同時，將禿房茶的檢測結(jié)果與茶葉植物[英紅九號（C. assamica）、鳳凰單從（C. sinensis）]部分品質(zhì)成分進行對比，以期了解和掌握禿房茶資源的嘌呤生物堿組分特異性和生化品質(zhì)含量，為禿房茶種質(zhì)資源的保存、利用與創(chuàng)新提供科學(xué)依據(jù)，為特異資源的發(fā)掘和茶樹新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

DHG-101烘箱（江蘇吳江市新意陽烘箱制造廠）；高效液相色譜（美國Agilent 1200）；UV-2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；AB204-N型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；DK-8D電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；SHZ-D （Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 材料

禿房茶鮮葉采摘于廣西金秀瑤族自治縣，英紅九號和鳳凰單從鮮葉采摘于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)茶樹資源圃，采摘時間均為2016年7月。

1.3 主要試劑

兒茶素單體（EC、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG）、嘌呤生物堿單體（可可堿、茶葉堿、咖啡堿）標(biāo)準(zhǔn)品、茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司 （St. Louis，Missouri，USA），苦茶堿標(biāo)準(zhǔn)品購自上海佰特因醫(yī)藥科技有限公司，水為超純水（>18.2 MΩ），乙腈、甲醇（色譜純）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。福林酚試劑、Na2CO3、三氟乙酸、茚三酮、氯化亞錫、三氯化鋁、磷酸緩沖液等均為市售國產(chǎn)分析純。

1.4 生化品質(zhì)成分測定方法

干茶樣品制備方法為鮮葉采集后液氮速凍至實驗室，微波固樣后冷凍干燥。水分測定按 GB /T8304-2002 恒重法進行；茶多酚含量測定按GB / T8313-2008福林酚法進行；游離氨基酸總量按GB / T8305-2002茚三酮法測定；黃酮類化合物總量按GB / T8307-2002三氯化鋁比色法測定。

生物堿、茶氨酸及兒茶素組分測定均采用高效液相色譜法（HPLC）測定 （Wang et al，2014），色譜柱為安捷倫Agilent Technologies C18 （4. 6 mm×250 mm，5 μm）。嘌呤生物堿檢測條件：流動相A 為超純水，流動相B為純甲醇；恒定梯度洗脫，即0～50 min，流動相B保持為10%；柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長232 nm；進樣量10 μL。四個嘌呤生物堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖如圖1：A所示。

茶氨酸檢測條件：流動相A為0. 5 ‰ 三氟乙酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫，5%～33% 流動相B 0～14 min；33%～5% 流動相B 14～20 min；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為199 nm；進樣量為5 μL。標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖如圖1：B所示。

兒茶素檢測條件：流動相A 為0. 5 ‰ 三氟乙酸水溶液，流動相B為甲醇；梯度洗脫，8%流動相B 0～8 min；8%～13%流動相B 8～20 min；13%～20%流動相B 20～25 min；20%～25%流動相B 25～30 min；25%～30%流動相B 30～35 min；30%～35%流動相B 35～40 min；35%流動相B 40～45 min；35%～8%流動相B 45～50 min；柱溫為38 ℃；流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為278 nm；進樣量為10 μL。八個兒茶素組分標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖如圖1：C所示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007，SPSS 19.0軟件進行處理、統(tǒng)計分析，結(jié)果用x±s表示，液相色譜圖采用 Agilent 1200 數(shù)據(jù)處理軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿單體組成與含量分析

一般茶種植物中，咖啡堿占干重的2%～4%，可可堿約0.05%，茶葉堿約0.002%，苦茶堿主要分布在苦茶的幼嫩芽葉部分，0.3%～3% （周晨陽等，2011）。生物堿具有多種生理功效，但各組分間具有明顯差異。咖啡堿是茶葉滋味鮮爽的主要組成物質(zhì)，適量的咖啡堿攝入對人體健康有益，但高劑量攝入會刺激中樞神經(jīng)，影響睡眠或引起興奮過度等負(fù)面作用（吳世玲，2013）。因此，保持茶葉原有風(fēng)味和其他功能成分的低咖啡堿茶及茶制品一直在研究。此外，苦茶堿可以改善動物單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的紊亂和保護神經(jīng)元，具有較強的抗抑郁作用和改善記憶效果（Li et al，2015；謝果，2010）。

由表1可知，禿房茶同時含有可可堿、咖啡堿和苦茶堿，可可堿含量最多，其變化范圍是14.37～39.72 mg·g-1，其次是苦茶堿，含量變化為5.82～9.10 mg·g-1，咖啡堿含量最低，含量變化維持為0.51～2.02 mg·g-1。以一芽二葉為例，可可堿的含量是苦茶堿的5倍，是咖啡堿的16倍。相同葉位比較發(fā)現(xiàn)，可可堿和咖啡堿隨著芽葉成熟度而逐漸降低，都以第1葉部位的含量最高，但苦茶堿在各葉位中變化平穩(wěn)，略有上升趨勢。與英紅九號和鳳凰單叢茶葉植物相比（圖2），禿房茶在生物堿的組成和含量配比上明顯區(qū)別與茶葉植物，獨含有苦茶堿組分，且可可堿含量最高，咖啡堿含量最低，保持在2.02 mg·g-1以下。此外，所有茶葉樣品中都沒有發(fā)現(xiàn)茶葉堿。

2.2 主要生化品質(zhì)成分分析

禿房茶的茶多酚、氨基酸、黃酮、茶氨酸和酚氨比結(jié)果如表 2所示，禿房茶與英紅九號茶葉植物的主要生化成分組成上相同，茶多酚在不同葉位的含量范圍是185.05～393.81 mg·g-1，氨基酸總量的變化范圍是13.74～23.74 mg·g-1，黃酮的變化范圍是15.66～18.38 mg·g-1，茶氨酸的變化范圍是13.81～24.42 mg·g-1，酚氨比值的變化范圍是12.37～19.77。茶多酚、游離氨基酸隨著葉位的增加逐漸下降，但是第3葉的茶多酚含量低于第2葉和第4葉含量，芽的茶多酚含量低于第1葉。黃酮含量在不同葉位分布含量變化不大，除芽含量是15.66 mg·g-1最低外，其他葉位均保持在18.0 mg·g-1左右。茶氨酸在芽和第3葉含量很高，分別達(dá)到21.92、24.42 mg·g-1，在其他葉位保持在14.0 mg·g-1左右。

2.3 兒茶素單體組成與含量分析

茶葉中的兒茶素是茶多酚的主體成分，占茶葉干重的12%～24%，占茶多酚總量的60%～80% （謝志英等，2014），它的組成和配比的差異是揭露茶樹資源進化類型的一個重要指標(biāo)，是決定茶葉品質(zhì)及其健康功效的重要組分。兒茶素可分為酯型和非酯型兒茶素（又稱“簡單兒茶素”），其中非酯型兒茶素主要包括兒茶素（C）、沒食子兒茶素（GC）、表兒茶素（EC）和表沒食子兒茶素（EGC）；酯型兒茶素主要包括表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）（黃亞輝等，2015），具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗菌消炎、預(yù)防心血管疾病、防輻射和減肥等作用（Hayat et al，2015；Uchiyama et al，2011；柳敏等，2016）。

從表3可以看出，禿房茶在兒茶素組分上種類與茶葉植物一樣，但含量配比上明顯差異，相同葉位中，EGCG含量最高，其次是C、ECG、EGC、EC、GC、CG，而GCG含量最低。同一兒茶素組分，基本規(guī)律符合第1葉>芽>第2葉>第3葉>第4葉，而一芽二葉的含量一般介于第1葉和第2葉之間。與茶葉植物（英紅九號）相比（圖3，以芽、一芽二葉為對照），兒茶素總量以禿房茶偏低，單一兒茶素組分除C外，其他組分都要比茶葉植物低，但是禿房茶的簡單兒茶素含量與茶葉植物相差不明顯，茶葉植物的酯型兒茶素總量明顯高于禿房茶。

3 討論與結(jié)論

茶樹作為多年生葉用經(jīng)濟作物，芽葉中的生化成分是決定茶葉品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在茶樹品種選育的初期，常通過檢測生化成分含量水平來判斷茶葉品質(zhì)和適制性，從而達(dá)到茶樹資源早期篩選、鑒別、評價的目的。禿房茶作為一類比較特殊的茶資源，在茶植物分類研究中占有重要地位。結(jié)合筆者在前期植物學(xué)分類、鑒定基礎(chǔ)上，本研究首次對禿房茶植株開展生化品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)禿房茶含有特征性成分—苦茶堿，而酯型兒茶素、總兒茶素、咖啡堿等含量均低于茶種，可可堿含量和酚氨比值在禿房茶中偏高。禿房茶生物堿組分及配比、兒茶素組分含量特別是酯型兒茶素含量的顯著差異，其可能的原因在于資源分類、遺傳本質(zhì)的不同，從而導(dǎo)致生物堿代謝模式，兒茶素代謝水平的差異，需進一步圍繞其植物形態(tài)學(xué)、遺傳進化關(guān)系等方面系統(tǒng)闡述禿房茶的進化地位。

目前，對于同類型的生物堿茶資源研究比較透徹的是由張宏達(dá)在中國廣東境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種天然無咖啡堿的茶樹資源—毛葉茶（張宏達(dá)等，1988；吳春蘭等，2014），該茶樹生物堿組成由可可堿代替咖啡堿，不含或微含咖啡堿，亦稱之為可可茶，在遺傳進化、茶葉加工、可可堿代謝機理等方面研究頗多（Ashihara et al，1998；Jin et al，2016；Wu et al，2014；文海濤等，2008）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禿房茶在生物堿組分含量上類似于可可茶，更為寶貴的是同時存在苦茶堿。從代謝途徑上分析，可可堿在咖啡堿合成酶作用下形成咖啡堿，咖啡堿經(jīng)過氧化、異構(gòu)化反應(yīng)可以形成苦茶堿（晏嫦妤等，2014），但是，茶樹中同時存在可可堿、咖啡堿、苦茶堿，且可可堿的含量最高的情況十分罕見，由此采取遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段研究其代謝途徑機制提供原材料。

兒茶素作為茶多酚的主體成分，占茶葉干重的12%～24%，茶多酚總量的60%～80% （謝志英等，2014），其在鮮葉中含量與茶類適制性、茶葉品質(zhì)、特定功能成分開發(fā)等密切相關(guān)。本研究中禿房茶資源的兒茶素組分含量大小依次為EGCG>C>ECG>EGC>EC>GC>CG> GCG，與茶葉植物相比，兒茶素總量和酯型兒茶素含量上低于茶葉植物，但非酯性兒茶素含量接近，保持在40～50 mg·g-1。從結(jié)構(gòu)上看，酯型兒茶素與非酯型兒茶素的區(qū)別僅在于C環(huán)3位上有無沒食子?；▌嗆姡?011），該部分的代謝機理可利用禿房茶和茶種結(jié)合，進一步探究禿房茶的遺傳演化路徑，并挖掘優(yōu)異基因和特異種質(zhì)?？傊?，本研究僅圍繞禿房茶生化品質(zhì)含量變化展開，明確了其嘌呤生物堿的組成特點和茶多酚、兒茶素、氨基酸、黃酮等主要生化品質(zhì)的含量規(guī)律。本研究表明禿房茶的嘌呤生物堿組成及配比、酯型兒茶素含量等存在顯著特異性，為不同風(fēng)味及功能茶開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并在茶樹種質(zhì)資源、茶葉加工、品種選育、功能性成分開發(fā)、次生代謝機理等方面將發(fā)揮重要作用。

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