李洵　王東生　姚葉

〔摘要〕 目的 觀察葛根交泰丸對2型糖尿病大鼠血清炎癥因子的影響，探討其治療2型糖尿病的可能機制。方法 采用高脂高糖和小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)2型糖尿病大鼠動物模型。將造模成功大鼠隨機分為模型組，西藥組，中藥組，每組10只，另設(shè)健康大鼠10只為正常組。西藥組予以羅格列酮4 mg/（kg·d）灌胃，中藥組予以葛根交泰丸4.6 g/（kg·d）灌胃，正常組及模型組予以等容量生理鹽水，每天1次。6周后，監(jiān)測大鼠空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 hPPG）、胰島素敏感指數(shù)和血清炎癥因子水平，并觀察胰島組織HE染色切片。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠FBG、2 hPPG和血清炎癥因子水平顯著升高（P<0.01，P<0.05），胰島素敏感指數(shù)顯著降低（P<0.01，P<0.05），胰島組織形態(tài)破壞嚴重。與模型組相比，葛根交泰丸組大鼠FPG、2 hPPG和血清炎癥因子水平顯著降低（P<0.01，P<0.05），胰島素敏感指數(shù)顯著升高（P<0.01，P<0.05），胰島組織形態(tài)有明顯改善。結(jié)論 葛根交泰丸的降糖作用機制可能與降低2型糖尿病大鼠血清炎癥因子水平，進而改善胰島素抵抗和修復(fù)受損胰島組織細胞有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 2型糖尿??；胰島素抵抗；炎癥因子；葛根交泰丸；血糖

〔中圖分類號〕R285.5；R587.1 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.004

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Gegen Jiaotai pills on inflammatory factors of type 2 diabetes rats， and to explore possible action mechanism of Gegen Jiaotai pills in treating type 2 diabetes. Methods Type 2 diabetes mellitus rat model was established by high fat diet combined with intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）. The successful model rats were randomly divided into model group， Western medicine group and traditional Chinese medicine group， with 10 rats in each group. Another 10 healthy rats were set as normal group. Western medicine group was perfused with rosiglitazone 4 mg/（Kg·d）， traditional chinese medicine group was perfused with Gegen Jiaotai pills 4.6 g/（Kg·d）， normal and model groups were perfused with the same volume of saline as the criteria of body volume， once daily. After 6 weeks， the FBG， OGTT 2 h， insulin sensitivity index and inflammatory factors were measured in earch group， meanwhile the histopathological changes of pancreas was observed by HE staining. Results Compared with the normal group， the levels of FPG， OGTT 2 h and inflammatory factors in the model group increased obviously （P<0.01， P<0.05）， while the insulin sensitivity index declined obviously （P<0.01， P<0.05）， and the morphology of pancreas was seriously damaged in model group. Compared with the model group， the levels of FPG， OGTT 2 h and inflammatory factors decreased obviously （P<0.01， P<0.05）， the insulin sensitivity index elevated obviously （P<0.01， P<0.05）， and the morphology of pancreas islet were significantly improved. Conclusion The hypoglycemic effect of Gegen Jiaotai pills may be related to reducing the level of inflammation factors of type 2 diabetes rats for improving insulin resistance and protecting the impaired pancreas.

〔Keywords〕 type 2 diabetes； insulin resistance； inflammation factors； Gegen Jiaotai pills； blood glucose

糖尿病是一種因胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用不足以致慢性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病的患病率逐年上升，已成為全球非傳染性疾病中最具流行性的疾病，而糖尿病中以2型為主，占比超過90%[1]。2型糖尿病病因復(fù)雜，發(fā)病機制至今尚未完全闡明，近年來炎癥學說備受關(guān)注，認為2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病[2]。目前多種具有抗炎作用機制的活性小分子藥物已經(jīng)上市或進入臨床研究階段，這些藥物單獨治療或與傳統(tǒng)降糖藥物聯(lián)用治療糖尿病均取得了令人滿意的效果，顯示了糖尿病抗炎治療的前景[3]。葛根交泰丸由葛根30 g，黃連10 g，肉桂5 g組成，是中南大學湘雅醫(yī)院中西結(jié)合科王東生教授自擬方，具有清火壯水、生津潤燥和平衡陰陽的功效，臨床運用該方治療2型糖尿病具有良好的降糖效果，但其具體作用機制并不明確。本研究通過動物試驗來觀察葛根交泰丸對2型糖尿病大鼠血清炎癥因子的影響，探討其治療2型糖尿病的可能機制，并為其臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與飼料

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達公司，飼養(yǎng)于中南大學湘雅醫(yī)學院動物實驗中心屏障環(huán)境內(nèi)，動物許可證號：SYXK（湘）2015-0017。飼養(yǎng)條件：每籠2～3只，自由進水、進食，溫度為（22±5）℃，濕度50%，光照時間12 h/d。SPF級普通飼料及高糖高脂飼料（58.75%普通飼料、20%豬油、10%蔗糖、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.25%膽酸鈉），購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。所有動物實驗均經(jīng)過中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物福利倫理審查委員會批準。

1.2 藥物與試劑

葛根交泰丸原方購自中南大學湘雅醫(yī)院中藥房，由葛根30 g，黃連10 g，肉桂5 g組成，水煎2次，混合濾過后濃縮為1 g/mL，滅菌后置于-4 ℃冰箱保存。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司生產(chǎn)，批號415G034；馬來酸羅格列酮，上海源葉有限公司，批號D13M6H1；水合氯醛，北京吉美生物技術(shù)有限公司，批號20160705；檸檬酸與檸檬酸三鈉，上海滬宇生物科技有限公司，批號20160406；胰島素、CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、瘦素、PAI-1 Total抗體，美國 EMD Millipore 公司。

1.3 主要儀器

瑞特GM300型血糖儀，臺灣華廣生物技術(shù)有限公司；Buchi R3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；pl303型電子天平，瑞士Buchi公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司設(shè)備廠；雷磁PHS-3C型PH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；XW-80型渦旋混勻器，上海第一醫(yī)科大學化器廠；TDL-46RC型普速低溫離心機，上海中科生物醫(yī)藥公司；Lumine×200型液相芯片分析系統(tǒng)，美國Luminex公司。

2 方法

2.1 造模與分組

雄性SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機選取10只為正常組，余大鼠采用高脂高糖和小劑量鏈脲佐菌（STZ）誘發(fā)2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus T2DM）大鼠動物模型[4]。正常組予以普通飼料喂養(yǎng)，其他組以高脂飼料喂養(yǎng)，42 d后，T2DM造模大鼠按35 mg/kg腹腔注射1% STZ溶液（STZ溶解于pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，避光冰浴，30 min內(nèi)用完），正常組腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。3 d后禁食8 h尾靜脈測空腹血糖，連續(xù)7 d監(jiān)測空腹血糖，待血糖穩(wěn)定且值大于16.7 mmol/L后提示造模成功。造模成功后隨機分為3組：模型組、羅格列酮組、葛根交泰丸劑量組，每組10只。

2.2 干預(yù)與標本收集

給藥量按陳奇所著《中藥藥理研究方法學》中大鼠與人體表面積系數(shù)折算，正常組及模型組均予以等容量生理鹽水，羅格列酮組予以羅格列酮4 mg/（kg·d）灌胃，葛根交泰丸劑量組予以4.6 g/（kg·d）灌胃，各組每日灌胃1次，連續(xù)灌胃給藥42 d，給藥容積為10 mL/kg。給藥42 d后，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，心臟采血，真空肝素管收集血樣，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清-80 ℃保存?zhèn)溆?。取大鼠胰腺，置?0%的甲醛溶液固定，常溫保存。

2.3 指標檢測

血糖檢測：第42天，禁食不禁水8 h，尾靜脈取空腹血測血糖（空腹血糖，fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）后予以無水葡萄糖2 g/kg灌胃（口服糖耐量試驗，oral glucose tolerance test，OGTT），2 h 后復(fù)測血糖（餐后2 h血糖，2 h-postprandial plasma glucose，2 hPPG）。胰島素敏感性指數(shù)利用定量胰島素敏感性評價指標（quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI）評定，根據(jù)公式QUICKI=1/[log（I0）+log（G0）]計算，I0代表空腹胰島素含量（μU/mL），G0代表空腹血糖濃度（mg/dL）。采用Milliplex多功能液相芯片分析技術(shù)檢測血清空腹胰島素、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、瘦素（Leptin）、纖溶酶原激活物抑制因子（plasminogen

activator inhibitor-1，PAI-1）。胰腺組織HE染色：10%的甲醛溶液固定后的胰腺組織，酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后常規(guī)切片，脫蠟、蘇木素染色后伊紅復(fù)染，重復(fù)脫水及透明步驟，樹膠固定后，光學顯微鏡下觀察胰腺組織的結(jié)構(gòu)變化。

2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件，各組間比較采用單因素方差分析法（滿足正態(tài)分布且方差齊性），或采用Kruskal-Wallis H檢驗法（未滿足正態(tài)分布且方差齊性），檢驗所有計量資料均用“x±s”表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 葛根交泰丸對大鼠FBG、2 hPPG血糖和QUICKI的影響

見表1，與正常組相比，模型組FBG、2 hPPG血糖顯著升高，QUICKI顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示2型糖尿病大鼠造模成功；與模型組相比，羅格列酮組和葛根交泰丸組FBG、2 hPPG血糖顯著降低，QUICKI顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），提示羅格列酮和葛根交泰丸可以明顯降低T2DM大鼠血糖，提高T2DM大鼠胰島素敏感性；與羅格列酮組相比，葛根交泰丸組FBG血糖顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），葛根交泰丸組2 hPPG血糖和QUICKI無統(tǒng)計學差異，提示葛根交泰丸對T2DM大鼠降糖和改善胰島素抵抗作用與羅格列酮相當，甚至優(yōu)于羅格列酮。

3.2 葛根交泰丸對大鼠胰腺病理結(jié)構(gòu)的影響

見圖1，正常組大鼠胰島為橢圓形細胞團，邊界清楚，島型豐滿，胰島細胞數(shù)較多，分布均勻且形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠胰島明顯萎縮，形態(tài)不規(guī)則，胰島細胞數(shù)目減少，部分細胞胞漿內(nèi)有空泡變性，細胞核固縮；羅格列酮組大鼠胰島邊界較為清晰，胰島細胞數(shù)量較多，少量細胞胞漿內(nèi)有空泡變性；葛根交泰丸組大鼠胰島邊界相對清晰，島組織較完整，形態(tài)較圓潤，島細胞數(shù)量較多，體積相對正常；提示羅格列酮和葛根交泰丸可以保護胰島細胞，對胰島組織形態(tài)有修復(fù)作用。

3.3 葛根交泰丸對大鼠血清炎癥因子的影響

見表2，與正常組比較，模型組CRP、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、Leptin、PAI-1水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，羅格列酮組與葛根交泰丸組CRP、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、Leptin、PAI-1水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

4 討論

胰島素抵抗和β細胞功能缺陷導致不同程度的胰島素缺乏是2型糖尿病發(fā)病的兩個主要環(huán)節(jié)，炎癥反應(yīng)不單可導致胰島素抵抗，亦能引起β細胞功能和結(jié)構(gòu)障礙，致使胰島素的合成減少和分泌障礙，甚至導致β細胞凋亡。2型糖尿病發(fā)病機制牽涉眾多的炎癥通路，僅靠觀察一種炎癥因子并不足以反映整體的炎癥程度[2]。大量文獻表明CRP、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、leptin、PAI-1這些炎癥因子均能直接或通過相互作用導致胰島素抵抗和胰島細胞凋亡[2，5-11]，因此降低上述炎癥因子水平能起到提高胰島素敏感性和保護胰島細胞存活的作用。

糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴病”范疇，其發(fā)病機制以“熱”為關(guān)鍵。《黃帝內(nèi)經(jīng)》和《諸病源候論》分別指出熱消水谷則多食、熱消津液則多飲，都說明了熱氣煎灼是導致消渴的主要病機?！督饏T要略》談到“消渴”因腎陽衰微，既不能蒸騰津液以上潤，又不能化氣以攝水，所以飲一斗，小便亦一斗，是為腎寒，火虛不能化水。因而消渴病病機為熱火內(nèi)盛，耗傷陰津，致津液虧損，臟腑失養(yǎng)，病久陰損及陽，陰陽兩虛。故治療消渴須從陰陽立論，調(diào)整水火之平衡[12]。交泰丸首見于明代韓懋所著的《韓氏醫(yī)通》，其記載有“黃連生用為君，佐官桂少許，煎百沸，入蜜，空心服，能使心腎交于頃刻”，指出該方具有清火壯水、交通心腎的作用。清代王世雄在其《四科簡效方》中始為其命名為交泰丸，并給出了藥物配伍劑量及具體主治。其書云“生川連五錢，肉桂心五分，研細，白蜜丸，空心淡鹽湯下，治心腎不交，怔忡不寐，名交泰丸?！苯惶┩枭锨逍幕?，下壯腎水，善治水火未濟，正好與消渴病熱盛陰虛、水火不濟病機相吻合，基于異病同治理論，交泰丸具有治療消渴病的理論基礎(chǔ)。葛根是治療消渴的常用藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》均謂其“主治消渴”，許多古方中都用葛根來治療消渴。后世醫(yī)家對葛根生津止渴、主治消渴作用做了大量論述，有的認為葛根可直接生津液，填充胃陰或者以其升散之性，鼓舞胃氣，通過氣化以生胃津；還有的認為葛根通過與芩連配伍達到撤熱保津的作用[13]。葛根交泰丸是中南大學湘雅醫(yī)院中西結(jié)合科王東生教授治療糖尿病經(jīng)驗方，方中君藥黃連味苦性寒，善瀉心肝胃之火，為治心火亢盛之要藥；臣藥葛根善除陽明內(nèi)熱，可生津潤燥，亦能制約黃連苦寒傷津的燥性；肉桂具有補火助陽、溫經(jīng)散寒和引火歸源的功效，少量佐使之，既可溫腎陽補腎水，又可制黃連之苦寒，使泄火而無涼遏之弊；針對糖尿病水火未濟、陰陽失衡病機，整方共奏清熱養(yǎng)陰、互濟水火和平衡陰陽之功。交泰丸、葛根、黃連、肉桂及其有效成分分別在現(xiàn)代試驗研究中均表現(xiàn)出良好的降糖效果，其可能機制與改善胰島素抵抗和保護胰島細胞存活相關(guān)[14-16]，但葛根交泰丸復(fù)方治療糖尿病的相關(guān)試驗研究較少。

針對2型糖尿病兩大主要發(fā)病機制，本研究選取與胰島素抵抗和β細胞存活關(guān)系最為密切的炎癥因子作為觀察對象。試驗結(jié)果表明，和正常組相比，模型組FBG和2 hPPG血糖顯著升高，胰島素敏感指數(shù)顯著降低（P<0.01），血清炎癥因子水平顯著升高（P<0.01），胰島組織形態(tài)破壞嚴重；和模型組相比，葛根交泰丸組FBG和2 hPPG血糖顯著降低，胰島素敏感指數(shù)顯著上升（P<0.01，P<0.05），血清炎癥因子水平顯著降低（P<0.01），胰島細胞數(shù)目較多，胰島組織形態(tài)較完整。因此猜測2型糖尿病大鼠血清炎癥因子水平升高導致胰島素抵抗和胰島組織細胞損傷，進而升高大鼠血糖；葛根交泰丸通過降低2型糖尿病大鼠血清炎癥因子水平，發(fā)揮改善胰島素抵抗和修復(fù)受損胰島組織細胞的作用，進而降低大鼠血糖。綜上所述，葛根交泰丸的降糖作用機制可能與降低血清炎癥因子水平，從而增強胰島素敏感性和保護胰島組織細胞有關(guān)。

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（本文編輯 楊 瑛）