馮菊 任鳳英 楊晨 李江紅 汪錫佳 陳林 石克金

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1209-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.14

摘 要 目的：建立測定卡巴他賽注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，流動相為水-乙腈-乙醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為230 nm，進樣量為20 μL。采用建立的方法測定3批卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果：卡巴他賽檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.039～11.60 μg/mL（r=0.999 8，n=7），檢測限為2×10-4 μg，定量限為8×10-4 μg；精密度試驗和重復(fù)性試驗的RSD<10.0%（n=6）。3批樣品單雜量為0.07%～0.08%，總雜量為0.26%～0.29%。 結(jié)論：建立的方法操作簡便，結(jié)果準確可靠，可用于卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)檢查。

關(guān)鍵詞 卡巴他賽注射液；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)；梯度洗脫

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of related substances in Cabazitaxel injection. METHODS： HPLC method was used. The determination was performed on Agilent Eclipse XDB-C18 column with mobile phase consisted of water-acetonitrile-ethanol （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and the detection wavelength was set at 230 nm. The sample size was 20 μL. Established method was used to determine related substances in 3 batches of Cabazitaxel injection. RESULTS： The linear relationship of cabazitaxel were 0.039-11.60 μg/mL （r=0.999 8， n=7）. The detection limit was 2×10-4 μg， and quantitation limit was 8×10-4 μg. RSD of precision and reproducibility tests were all lower than 10.0% （n=6）. The amount of single impurity in 3 batches of samples ranged 0.07%-0.08%， and total amount of impurities were 0.26%-0.29%. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate and reliable， can be used for the determination of related substances in Cabazitaxel injection.

KEYWORDS Cabazitaxel injection； HPLC； Related substance； Gradient elution

前列腺癌是臨床中較為常見的一種男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。在我國隨著人們生活方式的改變、 人口老齡化、通過逐漸普及的前列腺特異抗原（PSA）篩查，發(fā)現(xiàn)前列腺癌發(fā)病率在逐年升高[1]。有研究[2-4]報道，卡巴他賽不僅對多西他賽敏感的腫瘤株有活性，對多西他賽不敏感的腫瘤也有活性，應(yīng)用范圍更廣，因此具有較好的發(fā)展前景。卡巴他賽（Cabazitaxel）是一種紫杉烷類藥，多由紅豆杉經(jīng)萃取的前體半合成制備而成[5]，用于治療晚期、抗激素型前列腺癌[6]?？ò退惥哂锌鼓[瘤作用強的特點[7]，其作用機制為抑制微管蛋白[8]，與多烯紫杉醇相似。在2010年6月17日獲美國FDA 批準上市，是獲得批準用于轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌的二線治療中首個及唯一一個提供顯著生存獲益的治療藥物[9-13]。其原料藥的有關(guān)物質(zhì)檢查方法已有相關(guān)文獻報道[14]。筆者采用已報道原料藥的有關(guān)檢查方法，對卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)進行檢查試驗，但是該報道的原料藥有關(guān)物質(zhì)的分析方法未檢測出主峰，所以得出該分析方法可能不適用于卡巴他賽注射液制劑分析。結(jié)合卡巴他賽原料在合成過程中會引入一些副產(chǎn)物和中間體[15-16]，其制劑過程中加入的輔料和制劑工藝中也可能引入的雜質(zhì)，這些有關(guān)物質(zhì)可能是無效或者危害人的生命，亦或者影響藥物的穩(wěn)定性，進而影響藥物的質(zhì)量[17]。到目前為止，在各國藥典中還未收載此藥。根據(jù)以上原因，筆者采用反相高效液相色譜法對卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)進行分析[18]，篩選出了能夠達到控制其有關(guān)物質(zhì)的分析方法，為卡巴他賽注射液有關(guān)物質(zhì)分析提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；XS205電子分析天平 （瑞士Mettler -Toledo公司）；AS5150A超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Agilent Eclipse XDB色譜柱（美國Agilent公司）；Capcell Pak MGⅡ色譜柱（日本資生堂公司）；Swell Chromplus色譜柱（成都思為科學(xué)儀器有限公司）；Agilent SB色譜柱（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

卡巴他賽對照品（批號：ws-120901，純度：98.55%）、卡巴他賽注射液（批號：150409、150410、150411，規(guī)格：1.5 mL ∶ 60 mg）以及雜質(zhì)對照ZJTI（批號：141205，純度：95.60%）、DXTS（批號：141207，純度：95.79%）、CI-12（批號：141103，純度：95.81%）、CI-23（批號：141219，純度：96.10%）、CI-24（批號：150121，純度：95.89%）均為自制。乙腈、乙醇均為色譜純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；水為流動相A，乙腈為流動相B，乙醇為流動相C，梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 溶劑 取200 mL的去離子水與800 mL乙腈混合，制成水-乙腈（2 ∶ 8，V/V）的混合液，超聲混勻，即可。

2.2.2 對照品溶液 取卡巴他賽工作對照品25 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用溶劑超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz，10 min）溶解并稀釋至刻度，搖勻，再取1.0 mL置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取卡巴他賽注射劑供試品適量（約相當(dāng)于卡巴他賽25 mg），置于50 mL量瓶中，用溶劑超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz，10 min）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗和檢測方法

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使卡巴他賽峰高約為滿量程的10%～20%。取對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，其峰面積的RSD不得超過2.0%，卡巴他賽峰的拖尾因子不得超過1.5。

2.3.2 檢測方法 取“2.2.2”“2.2.3”項下對照品溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至卡巴他賽峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按外標法以峰面積計算，任一單個雜質(zhì)峰面積的RSD均不得超過0.2%，總雜質(zhì)峰面積的RSD不得超過1.0%。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果 取對照品溶液，按“2.3.1”項下方法進行試驗，連續(xù)6次進樣。結(jié)果，主峰面積的RSD為0.17%，主峰拖尾因子為1.14～1.15，符合系統(tǒng)適用性試驗的要求。色譜圖見圖1的A圖。

2.4 色譜柱耐用性試驗

選擇Agilent XDB、Capcell Pak MGⅡ、Swell Chromplus、Agilent SB等色譜柱進行試驗，對分離度、雜質(zhì)峰個數(shù)、拖尾因子等進行比較。結(jié)果表明，采用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱檢出雜峰個數(shù)最多，分離度最大，主峰對稱性最好，故選用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱檢測卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)。色譜柱篩選結(jié)果見表2。

2.5 專屬性考察

2.5.1 本品主組分與雜質(zhì)、中間體、輔料的分離 取按處方比例配制的不含主成分的混合空白輔料溶液（吐溫80）約625 mg，置于50 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。分別取中間體ZJTI、DXTS、CI-12、CI-23、CI-24適量，加溶劑制成濃度均為每1 mL中含0.02 mg的溶液，取此溶液少量（1 mL）和供試品溶液（5 mL）混合置于10 mL量瓶中，按“2.1”項下色譜條件進行試驗。結(jié)果表明，空白輔料不干擾本品的測定，中間體能與卡巴他賽完全分離。色譜圖見圖1的B、C、D圖。

2.5.2 降解試驗 取供試品（批號：150409）適量（約相當(dāng)于卡巴他賽25 mg），置于50 mL量瓶中，分別經(jīng)強酸（0.1 mol/L的鹽酸溶液，室溫放置2 h）、強堿（0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，室溫放置10 min）、高溫（120 ℃ 時放置2.5 h）、氧化（1 mL的雙氧水溶液，在120 ℃放置20 min）、強光[（4 500±500） lx，2 h]降解，酸堿破壞樣品分別中和后，均用溶劑稀釋至刻度，分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。結(jié)果表明，降解物質(zhì)與主峰均能較好地分離。色譜圖見圖1的E、F、G、H、I圖。

2.6 線性關(guān)系考察

取卡巴他賽工作對照品適量，加溶劑依次配制成11.60、7.73、3.87、1.93、0.77、0.39、0.039 μg/mL濃度的溶液。按“2.1”項下色譜條件測其主峰面積分別為360 964、243 926、122 223、66 348、24 852、12 390、1 218。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，線性回歸方程為y=31 105x+1 850.49（r= 0.999 8）。結(jié)果表明，卡巴他賽在0.039～11.60 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 檢測限與定量限考察

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結(jié)果，卡巴他賽的檢測限為2×10-4 μg，定量限為8×10-4 μg。

2.8 精密度試驗

2.8.1 進樣精密度 稱取625 mg供試品（主藥量約25 mg）于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋定容配成含卡巴他賽0.5 mg/mL的供試液，按“2.2.2”項下方法配制對照液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。結(jié)果，最大單雜的RSD為8.94%（n=6），總雜的RSD為4.76%（n=6），表明進樣精密度良好。

2.8.2 中間精密度 對同一樣品不同日期、不同操作人員按有關(guān)物質(zhì)檢查方法測定，進行中間精密度試驗。結(jié)果，最大單雜的RSD分別為9.27%、8.21%（n=6），總雜的RSD分別為6.38%、5.39%（n=6），表明中間精密度試驗良好。

2.9 重復(fù)性試驗

稱取625 mg供試品（批號：150409）（主藥量約25 mg）6份，分別置于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋定容配成含卡巴他賽0.5 mg/mL的供試液，并按“2.2.2”項下方法配制對照液，取20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。結(jié)果，最大單雜的RSD為8.21%（n=6），總雜的RSD為5.39%（n=6），表明重復(fù)性試驗良好。

2.10 卡巴他賽注射液測定結(jié)果

取3批樣品適量，各3份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算最大單雜（未知）量和總雜量。結(jié)果，批號為150409、150410、150411的卡巴他賽樣品其最大單雜（未知）量分別為0.07%、0.07%、0.08%，總雜量分別為0.28%、0.29%、0.26%，測得結(jié)果穩(wěn)定，表明本檢測方法可行。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在篩選試驗條件時，筆者發(fā)現(xiàn)柱溫和流速對分離度和雜峰個數(shù)無影響，而柱溫低或流速增大可使色譜柱的柱壓會增加，故根據(jù)試驗實際情況，選擇柱溫為35 ℃，流速為1 mL/min。

3.2 溶劑的選擇

在選擇溶劑的過程中，主要考慮到卡巴他賽幾乎不溶于水，溶于乙醇、乙腈，輔料（吐溫）易溶于水的性質(zhì)，初步選擇水、乙腈和乙醇3種試劑作為溶劑，而經(jīng)試驗比較發(fā)現(xiàn)有無乙醇對溶液穩(wěn)定性沒有影響，最終采用水-乙腈（2 ∶ 8，V/V）為溶解樣品的溶劑。

3.3 卡巴他賽主組分與雜質(zhì)的分離

在專屬性試驗時，采用二極管陣列檢測器，取經(jīng)過各種降解后所得的樣品溶液進行試驗，卡巴他賽主峰的峰純度因子均在999以上，表明卡巴他賽與雜質(zhì)能夠完全分離，故本法能準確、可靠地測定卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)。

3.4 進樣濃度的選擇

以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的濃度梯度進行試驗，隨著濃度的增加檢測到的雜質(zhì)峰有所增加，但當(dāng)濃度增加到0.5 mg/mL時，雜峰個數(shù)不再增加，又考慮到色譜柱使用壽命，最終選擇0.5 mg/mL的溶液為進樣濃度。

綜上，本研究建立的方法操作簡便，結(jié)果準確可靠，可用于卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)檢查。

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（收稿日期：2017-12-23 修回日期：2018-03-15）

（編輯：余慶華）