蔣大程，高 珊，高海倫，邱念偉

(曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165)

1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)了測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量的方法，此法的原理是蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基(酚基)與酚試劑(磷鎢酸-磷鉬酸)可發(fā)生藍(lán)色反應(yīng)，藍(lán)色化合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比。這一方法被命名為Folin-酚試劑法，該法的缺點(diǎn)是靈敏度較低[1]。1951年，Lowry對(duì)Folin法進(jìn)行了改進(jìn)，他發(fā)現(xiàn)在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵可與堿性銅試劑中的Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與Folin酚試劑反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色化合物[1-2]，這一改進(jìn)大大提高了測(cè)定的靈敏度，改進(jìn)后的方法被稱為“Lowry法”。不過(guò)Lowry法仍存在測(cè)定范圍窄、使用試劑多、干擾物質(zhì)多、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、反應(yīng)時(shí)間難以控制等缺點(diǎn)[3-4]。1976年美國(guó)科學(xué)家Bradford用考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法來(lái)定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量?？捡R斯亮藍(lán)法是目前實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)、靈敏度最高的一種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法[5-6]。它將比色法和染料結(jié)合法相結(jié)合，與其他傳統(tǒng)方法相比具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類生物材料的可溶性蛋白含量測(cè)定，是生物化學(xué)、植物生理學(xué)、分子生物學(xué)、食品科學(xué)等實(shí)驗(yàn)課程中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。首先，考馬斯亮藍(lán)法所需的樣品量少，蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的復(fù)合物顏色穩(wěn)定，消光系數(shù)高，光吸收值隨蛋白質(zhì)含量的變化比Lowry法靈敏得多，可檢測(cè)的蛋白質(zhì)數(shù)量低達(dá)1 μg[7]。其次，該方法測(cè)定速度快，完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5 min左右。第三，不像Lowry法那樣試劑較多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間[8]，考馬斯亮藍(lán)法操作簡(jiǎn)便，只需加一種考馬斯亮藍(lán)試劑，適合于大批量樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。此外，該方法還具有干擾物質(zhì)少的優(yōu)點(diǎn)。

考馬斯亮藍(lán)法雖然操作簡(jiǎn)單，但在操作過(guò)程中，仍有許多細(xì)節(jié)問(wèn)題容易被忽視，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差甚至錯(cuò)誤。相關(guān)教材和文獻(xiàn)中只介紹了3～4項(xiàng)重要的注意事項(xiàng)[9-11]，還有很多操作細(xì)節(jié)并未提及。曲阜師范大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心在長(zhǎng)期的教學(xué)和科研中，積累了測(cè)定蛋白質(zhì)含量的豐富經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了30余條實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)，分為儀器設(shè)備的操作、試劑的配制與保存、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、樣品蛋白質(zhì)的提取、樣品吸光度的測(cè)定5個(gè)方面，旨在培養(yǎng)精益求精、一絲不茍的科學(xué)態(tài)度。生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中細(xì)節(jié)決定成敗，掌握這些細(xì)節(jié)有助于提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和成功率，也有助于提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能。

1 實(shí)驗(yàn)原理

在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G250(Coomassie brilliant blue G250)染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸和賴氨酸)[12]和芳香族氨基酸的殘基通過(guò)疏水力相結(jié)合，從而使染料的最大吸收峰(lmax)由波長(zhǎng)465 nm變?yōu)椴ㄩL(zhǎng)595 nm，溶液的顏色由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色[13]。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(1～1 000 μg/mL)，溶液在波長(zhǎng)595 nm處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可通過(guò)測(cè)定樣品在波長(zhǎng)595 nm的吸光度計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)濃度；然后根據(jù)公式計(jì)算生物樣品的可溶性蛋白質(zhì)含量。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

2.1 試劑

1)考馬斯亮藍(lán)試劑。

取考馬斯亮藍(lán)G250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%W/V磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，過(guò)濾后備用。

2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

用0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)將結(jié)晶牛血清蛋白配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

3)磷酸緩沖液。

用蒸餾水將KH2PO42.12 g和K2HPO45.56 g分別溶解，混合后定容至200 mL，配成0.2 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液。

2.2 儀器

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、比色皿、移液槍、冷凍離心機(jī)、離心管、分析天平、藥匙、研缽、研杵、燒杯、量筒、試管、試管架、玻璃棒和剪刀。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1)取7支試管，按表1平行操作，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和考馬斯亮藍(lán)后，立即搖勻，5～20 min內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光值，填入表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以A595為縱坐標(biāo)，參照文獻(xiàn)[14]的方法，用Excel辦公軟件繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 未知樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定

取待測(cè)植物材料1.0 g，用少量石英砂和10 mLPBS研磨提取，研磨后經(jīng)兩步離心(12 000 g 6 min和26 900 g 16 min)，取其上清液即為蛋白提取液。將0.1 mL蛋白提取液和5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑混合，2 min后即可測(cè)定其吸光度。每個(gè)樣品做5個(gè)重復(fù)，取其吸光度的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出樣品蛋白質(zhì)濃度。然后代入式(1)計(jì)算植物材料蛋白質(zhì)含量。

(1)

4 注意事項(xiàng)

4.1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

1)用到的所有玻璃器皿必須用蒸餾水清洗干凈，晾干備用。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，仍有一些物質(zhì)干擾蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有強(qiáng)堿性緩沖液、去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉等[15]。所以在清洗玻璃器皿過(guò)程中使用去污劑、強(qiáng)堿性物質(zhì)時(shí)，一定要沖洗干凈。

2)比色皿內(nèi)外壁都需清洗，保證比色皿干凈透明，晾干或冷風(fēng)吹干后待用(濕潤(rùn)的比色皿壁接觸考馬斯亮藍(lán)溶劑后會(huì)發(fā)藍(lán))。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，測(cè)定前可先用少量待測(cè)液潤(rùn)洗比色皿，然后再進(jìn)行測(cè)定。

3)待測(cè)液體積大約為比色皿容積的2/3即可，溶液過(guò)滿容易外溢。流到比色皿外壁的待測(cè)液要及時(shí)用沾有酒精的吸水紙擦拭干凈，以免影響比色皿的透光率。

4)比色皿使用后，會(huì)殘留藍(lán)色染料，干燥后很難清洗，須用酒精及時(shí)洗滌干凈。一定不能將比色皿長(zhǎng)期浸泡在酒精中，否則比色皿會(huì)因粘膠被溶解而散架(比色皿上的兩塊透明玻璃是用膠黏上的)。

5)拿取比色皿時(shí)，只能接觸兩側(cè)的毛玻璃面，嚴(yán)禁用手指觸摸透光面[16]，以免留下指紋，影響測(cè)定準(zhǔn)確性。

6)嚴(yán)禁用硬物擦拭比色皿的透光面，以免產(chǎn)生劃痕；應(yīng)使用鏡頭紙或絲綢順著同一方向擦拭干凈。

7)考馬斯亮藍(lán)可以與石英比色皿產(chǎn)生強(qiáng)烈的結(jié)合，因此本實(shí)驗(yàn)建議使用玻璃或塑料比色皿[17]。

8)測(cè)試的同一批樣品必須使用同一套比色皿[18]，不同廠家、不同批次的比色皿透光率不同，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。

9)分光光度計(jì)使用前應(yīng)預(yù)熱20 min[19]，使光源達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此時(shí)測(cè)量的數(shù)值會(huì)比較穩(wěn)定。

10)使用移液管或移液槍移取液體體積要精確，為減小人為誤差，最好由同一個(gè)人操作。

4.2 試劑的配制與保存

1)在配制考馬斯亮藍(lán)試劑時(shí)，應(yīng)先加入考馬斯亮藍(lán)G250粉末和乙醇，溶解后再加入磷酸，最后用蒸餾水定容?？捡R斯亮藍(lán)試劑必須要經(jīng)過(guò)過(guò)濾后才能使用，濾液應(yīng)為淺棕紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)色，配制好的試劑可在4℃下棕色瓶中保存1個(gè)月。

2)考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種類型。測(cè)定蛋白質(zhì)含量必須使用考馬斯亮藍(lán)G-250；考馬斯亮藍(lán)R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)緩慢，可以被洗脫，只能用于蛋白質(zhì)電泳條帶的染色[20]。

3)應(yīng)預(yù)先通過(guò)微量凱氏定氮法測(cè)定結(jié)晶牛血清蛋白的氮含量，根據(jù)其純度，再用磷酸緩沖液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液[13]。配置好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液分裝后可冷凍保存6個(gè)月。

4)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液母液(1 mg/mL)可以先分別稀釋成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別吸取0.1 mL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以減少取樣誤差，稀釋方法如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的稀釋

5)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、考馬斯亮藍(lán)試劑、磷酸緩沖液恢復(fù)至室溫后再使用，因?yàn)榈蜏貢?huì)影響染色效果，并使比色皿壁產(chǎn)生水霧。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1)各種蛋白質(zhì)中堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)法用于測(cè)定不同蛋白質(zhì)含量時(shí)有較大偏差，為減少這方面的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，一般以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

2)由于試劑保存時(shí)間以及貯藏條件等因素的影響，各試劑成分會(huì)有變化，影響測(cè)量結(jié)果。因此，每次實(shí)驗(yàn)均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，若考馬斯亮藍(lán)試劑不足，重新配置后，應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每個(gè)濃度點(diǎn)應(yīng)做3個(gè)重復(fù)，若無(wú)異常值，則取3個(gè)重復(fù)的平均值；若有異常數(shù)據(jù)，則去掉異常數(shù)據(jù)后取平均值。若某個(gè)濃度點(diǎn)的3個(gè)數(shù)據(jù)全部異常，則應(yīng)重做該濃度點(diǎn)或者刪除該濃度點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線上濃度點(diǎn)應(yīng)不少于5個(gè)(含零濃度點(diǎn))。

5)一般要求標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性[14]。

6)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度過(guò)高時(shí)，該濃度點(diǎn)會(huì)偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)將該點(diǎn)刪除。

7)徒手繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線誤差較大，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)采用Excel等辦公軟件繪制[14]。

4.4 樣品蛋白質(zhì)的提取

1)每種樣品建議做5個(gè)重復(fù)以上，取材要均一，以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

2)蛋白質(zhì)提取過(guò)程中用到的研缽、研杵等儀器以及磷酸緩沖液需提前預(yù)冷，提取過(guò)程(包括離心)應(yīng)在低溫(0～4℃)下進(jìn)行，以防止植物組織中的蛋白酶降解蛋白質(zhì)。

3)研磨要充分，研磨時(shí)應(yīng)先加2 mL磷酸緩沖液，研磨成勻漿后(提取液加入過(guò)多，葉片漂浮在液面上，難以研磨充分)，再用2～3 mL磷酸緩沖液繼續(xù)研磨提取。最后用剩余的磷酸緩沖液沖洗研缽和研杵，合并蛋白質(zhì)提取液，混勻后離心。

4.5 樣品吸光度的測(cè)定

1)測(cè)定樣品在波長(zhǎng)595 nm處的吸光度時(shí)，以5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑和0.1 mL磷酸緩沖液混勻后調(diào)零。

2)在加入考馬斯亮藍(lán)溶液和蛋白樣品混勻后，染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合需約2 min達(dá)到平衡。在5～20 min內(nèi)，結(jié)合最為穩(wěn)定，此時(shí)測(cè)定吸光度最為可靠[21]。超過(guò)1 h，蛋白質(zhì)就會(huì)明顯沉淀。

3)為避免反復(fù)清洗比色皿，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光度時(shí)，可從低濃度到高濃度測(cè)定，這樣干擾和誤差較小。

4)做標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定樣品時(shí)，吸光度應(yīng)在0.1～0.6之間(常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)中吸光度一般要求在0.1～0.8)，因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)溶液在波長(zhǎng)595 nm處的本底吸光度較高，約為0.2～0.3。所以樣品吸光度高于0.6時(shí)，吸光度與蛋白質(zhì)濃度已不成正比，此時(shí)應(yīng)將蛋白質(zhì)提取液用磷酸緩沖液稀釋至合適濃度后再進(jìn)行測(cè)定。

5)不必每測(cè)定一個(gè)樣品就清洗一次比色皿，同一處理的多個(gè)重復(fù)樣品可用同一個(gè)比色皿連續(xù)測(cè)定。不同處理的樣品應(yīng)清洗比色皿，并晾干或吹干后再進(jìn)行測(cè)定。

6)測(cè)定結(jié)束后可用乙醇將比色皿中的藍(lán)色染料溶解洗滌下來(lái)，然后用蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

7)考馬斯亮藍(lán)試劑不與單體氨基酸以及相對(duì)分子量小于3 kDa的多肽結(jié)合，多肽類激素和很多重要的活性肽分子量都低于3 kDa，考馬斯亮藍(lán)法不能用于這些蛋白質(zhì)和氨基酸的濃度測(cè)定[22]。

5 結(jié)束語(yǔ)

蛋白質(zhì)含量測(cè)定是生物學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)涉及很多技術(shù)細(xì)節(jié)和專業(yè)知識(shí)，忽視任何一個(gè)細(xì)節(jié)都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的初學(xué)者測(cè)定的結(jié)果往往是錯(cuò)誤的，他們既不知道實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，也不知道實(shí)驗(yàn)失敗的原因。本文從5個(gè)方面系統(tǒng)總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的操作細(xì)節(jié)，不僅有助于學(xué)生熟練掌握該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而且對(duì)其他類似實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目也具有很好的參考價(jià)值。本文已經(jīng)將上述實(shí)驗(yàn)技術(shù)細(xì)節(jié)應(yīng)用到科研和教學(xué)中，使得蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性大大提高，也拓展了學(xué)生的專業(yè)知識(shí)，提高了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能，培養(yǎng)了學(xué)生嚴(yán)格、認(rèn)真、細(xì)致的科研素質(zhì)。