王錢虎

310006 杭州市第一人民醫(yī)院中心實驗室

前列腺腺癌（prostatic adenocarcinoma，PCa）是常見的男性泌尿生殖系惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)其發(fā)病率居第2位，死亡率居第5位[1]。在我國PCa是男性泌尿生殖系發(fā)病率最高的腫瘤，其年發(fā)病率高達(dá)12.07%。PCa早期臨床癥狀不典型，確診時大多已為進(jìn)展期，24%～35%的患者在初診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。PCa分為腺癌、腺鱗癌、導(dǎo)管腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、尿道上皮癌等五大類，其中腺癌占90%以上[3]。自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，在機(jī)體生理病理過程發(fā)揮廣泛而重要的作用；而且，自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展之間有密切關(guān)系[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬在PCa的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[5]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測PCa中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)基因5（autophagyrelated gene 5，Atg5）的表達(dá)情況，并分析其與Gleason分級、前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）和臨床各參數(shù)的相關(guān)性，以探討自噬活動在PCa發(fā)病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014年3月至2016年3月在我院病理科保存的經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢PCa標(biāo)本60例（觀察組），患者年齡 55～72（69.4±10.2）歲；按照 Gleason評分[6]：高分化（2～4分）16例，中分化（5～7分）18例，低分化（8～10分）26例。同時選擇良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）標(biāo)本15例作為對照組，患者年齡 53～70（67.3±10.4）歲。兩組患者術(shù)前均未行放化療或內(nèi)分泌治療。兩組患者年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

1.2 主要試劑 PSA檢測試劑盒（美國雅培公司）；Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5兔抗人單克隆抗體（美國 EPITMICS公司）；鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物連接法(SP)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（武漢博士德生物技術(shù)公司）。

1.3 血清PSA的檢測 在清晨安靜情況下抽取患者靜脈血4ml，采用化學(xué)免疫發(fā)光法檢測PSA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.4 免疫組化染色 石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟及水化，高壓熱修復(fù)抗原，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，依次加入 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5一抗（均為 1∶1 000稀釋），洗滌后加入辣根過氧化酶標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明及封片。

1.5 陽性結(jié)果判斷 由2位高年資病理醫(yī)師采用盲法獨立閱片，每張切片至少觀察5個高倍鏡視野。參照文獻(xiàn)[7]，按照染色強(qiáng)度評分：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐黃色計3分。按照陽性細(xì)胞所占百分比評分：陰性計0分；陽性細(xì)胞＜10%計1分，＞10%計2分，＞50%計3分，＞75%計4分?？偡e分（即上述2項評分的乘積）：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為中強(qiáng)陽性，＞6分為強(qiáng)陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用百分比表示，組間及不同臨床病理特征間自噬相關(guān)蛋白陽性率比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5陽性表達(dá)率的比較 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5陽性表達(dá)均主要位于細(xì)胞質(zhì)。觀察組中Beclin1、LC3－Ⅱ陽性表達(dá)率明顯低于對照組，但Atg5陽性表達(dá)率顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者B ec l in1、LC3-Ⅱ、A t g5陽性表達(dá)率的比較[例（%）]

2.2 PCa組織中 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5 表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系 Beclin1、LC3－Ⅱ的表達(dá)與Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05）；而與年齡無關(guān)（P＞0.05）。Atg5的表達(dá)與年齡、Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均P＞0.05）。見表 2。

表2 P C a組織中B ec l in1、LC3-Ⅱ、A t g5蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系[例（%）]

2.3 相關(guān)性分析 Beclin1與LC3－Ⅱ呈正相關(guān)（r=0.574，P＜0.05），而 Beclin1和 LC3－Ⅱ與 Atg5呈負(fù)相關(guān)（r=－0.513、－0.525，均 P＜0.05）。Beclin1 和 LC3－Ⅱ與 Gleason評分呈正相關(guān)（r=0.542、0.547，均 P＜0.05），而Atg5與Gleason評分無明顯相關(guān)（r=0.035，P＞0.05）。

3 討論

自噬是真核生物特有的進(jìn)化上高度保守的代謝方式，它能通過清除氧自由基和受損細(xì)胞器，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定，抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展；如自噬活性受損時，也可促進(jìn)細(xì)胞惡變及腫瘤的發(fā)展[8]。自噬體的形成是一個涉及兩種泛素樣系統(tǒng)和多個自噬相關(guān)蛋白的多步驟過程，自噬體形成后與溶酶體融合，進(jìn)而形成自噬溶酶體，將其吞噬的內(nèi)容物降解掉。自噬體形成主要包括三個階段：起始階段：自噬小泡膜開始形成；延長階段：自噬小泡膜不斷彎曲、延長，進(jìn)而包裹被吞噬的成分；融合階段：自噬小泡與溶酶體融合，通過溶酶體酶將被吞噬成分降解，然后自噬體膜脫落以再循環(huán)利用。細(xì)胞內(nèi)的自噬活動在正常條件下處于較低水平，然而在多種誘導(dǎo)因素（如細(xì)胞因子、缺氧、缺乏營養(yǎng)等）的作用下可發(fā)生迅速增強(qiáng)。自噬實質(zhì)上是細(xì)胞內(nèi)消化大分子的過程，是自我保護(hù)的過程，其在腫瘤發(fā)生中的具體作用尚存在爭議。自噬活動可有利于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的變化，降低其凋亡。但是，研究發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤中常存在自噬調(diào)節(jié)基因的突變，提示自噬有一定的抗癌效應(yīng)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的變化，且在同一腫瘤的不同階段也存在著自噬活性的差異，提示自噬相關(guān)蛋白表達(dá)失調(diào)可能是一種新的腫瘤發(fā)生機(jī)制[10]。自噬在腫瘤治療中的具體作用同樣存在爭議。腫瘤細(xì)胞可通過自噬對一些抗腫瘤方法產(chǎn)生抵抗；而另一些抗腫瘤方法可通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[11]。關(guān)于自噬究竟是抑制腫瘤的發(fā)生的屏障，還是腫瘤的適應(yīng)性應(yīng)答是現(xiàn)在研究的熱點[12]。PCa的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其發(fā)生是遺傳、環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。有研究顯示，自噬相關(guān)基因Beclin1在PCa患者中存在雜合性的丟失。而且，自噬能增加PCa對不同療法（包括抗激素療法、DNA損傷劑和放射療法）的敏感度，提示自噬在PCa的發(fā)病中可能起到抑制作用[13]。自噬在PCa發(fā)生、發(fā)展中的作用方式備受關(guān)注，PCa和內(nèi)分泌密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PCa中自噬和雄激素水平相關(guān)聯(lián)，雄激素可對PCa細(xì)胞自噬發(fā)揮一定的調(diào)控作用，而通過調(diào)控自噬過程進(jìn)而實現(xiàn)靶向性誘導(dǎo)PCa細(xì)胞的凋亡是一個具有研究潛力的治療方向[14]。

Beclin1為酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，是自噬體形成過程中的一個必需因子，它可介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡，進(jìn)而調(diào)控自噬體的形成及成熟[15]。LC3為酵母自噬相關(guān)蛋白Atg8的同源體。LC3一般以可溶性LC3-Ⅰ的形式存在；當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3和自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄缘腖C3-Ⅱ。而LC3-Ⅱ的表達(dá)與自噬活性呈正比，是公認(rèn)的自噬活性標(biāo)記[16]。自噬過程受到自噬相關(guān)基因（Atg）的嚴(yán)格調(diào)控，而Atg5在自噬體形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。在自噬體形成過程中，Atg5和Atg12結(jié)合，形成Atg5-Atg12泛素樣連接系統(tǒng)，再和外膜結(jié)合以促進(jìn)自噬體膜的延伸，最后形成自噬體[18]。本研究結(jié)果顯示，PCa組織中 Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)明顯低于BPH組織，提示Beclin1、LC3-Ⅱ在PCa發(fā)生早期發(fā)揮抑癌作用。PCa組織中Atg5表達(dá)顯著高于BPH組織，提示Atg5可能促進(jìn)了PCa發(fā)生、發(fā)展。

Gleason評分因其與PCa的生物學(xué)行為及預(yù)后有良好的相關(guān)性，已得到廣泛的臨床應(yīng)用，評分越高提示癌細(xì)胞分化和預(yù)后越差。研究發(fā)現(xiàn)，Gleason評分≥8分后切緣陽性率顯著高于＜8分者[19]。PSA是早期篩查PCa的重要指標(biāo)，其正常范圍0～4.0ng/ml，大多數(shù)PCa患者血清PSA＞4.0ng/ml，但仍存在一定的假陽性和假陰性[20]。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Beclin1、LC3-Ⅱ的表達(dá)差異與Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)；而與年齡無關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin 1、LC3-Ⅱ在PCa中陽性表達(dá)率明顯低于正常前列腺增生組織，而兩者在晚期PCa（C+D期）中陽性表達(dá)明顯高于早期（A+B 期）[21]。有研究顯示，Beclin-1、LC3-Ⅱ參與PCa的發(fā)生、發(fā)展；但Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)與Gleason分級無明顯相關(guān)[22]。上述結(jié)果提示，Beclin1、LC3-Ⅱ在PCa的不同發(fā)展階段發(fā)揮不同的作用。Atg5在PCa組織中表達(dá)明顯高于BPH，但Atg5表達(dá)與Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移均無顯著差異，與前期研究結(jié)果一致[23]，提示Atg5高表達(dá)可能是PCa變得前期分子時間，但其具體機(jī)制尚未明確。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在PCa組織中表達(dá)失調(diào)，提示自噬活動增強(qiáng)和自噬體形成增多在其發(fā)展過程中起著重要作用，進(jìn)一步深入探討自噬在PCa發(fā)病中的作用機(jī)制對開辟新的治療途徑有重要意義。