劉尊濤，胡定輝，杜 琎，李 航，李鴻雁

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胸心外科，江蘇 南京 210028；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胸心外科，江蘇 南京 210009）

為了探究復(fù)方丹參滴丸處理對大鼠移植心臟心肌細(xì)胞保護(hù)作用及細(xì)胞凋亡線粒體途徑，研究利用大鼠移植心臟缺血再灌注損傷模型，分析復(fù)方丹參滴丸處理對大鼠移植心臟心肌細(xì)胞產(chǎn)生的影響，為臨床應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

SD大鼠，復(fù)方丹參滴丸，兔抗鼠Bcl-2及Bax多克隆抗體、HRP-羊抗鼠二抗、TUNEL試劑盒，Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀等。

2 手術(shù)方法

受體的制備。受體鼠術(shù)前禁食6～8 h。用1%戊巴比妥鈉按50mg/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉后固定四肢。腹部脫毛，碘伏消毒，腹部正中切口進(jìn)腹，顯露腹主動脈和下腔靜脈備用。

供心摘取。同受體麻醉，固定，術(shù)區(qū)備皮，消毒。腹部正中切口進(jìn)腹，暴露下腔靜脈經(jīng)其注入125u/mL肝素鹽水2mL并剪斷放血，迅速打開胸腔，游離修剪供心，置入冰水混合物中保存。

供心移植。暴露吻合口部位，采用Ono氏術(shù)，供心升主動脈和主肺動脈分別與受體的腹主動脈和下腔靜脈作端側(cè)吻合。供體心臟恢復(fù)血供之后大多先出現(xiàn)纖顫，用40℃左右生理鹽水澆淋心臟使之快速復(fù)溫，心臟復(fù)跳。觀察無出血后，縫閉腹腔，燈照保溫1 h。

術(shù)后處理與觀察。手術(shù)后根據(jù)術(shù)中出血情況補(bǔ)入生理鹽水5～6mL，保溫。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

SD大鼠48只，隨機(jī)分為4組，每組6例心臟移植（其中供體6只，受體6只），分組如下：①單純移植組，術(shù)前未用任何藥物。②缺血后處理組：術(shù)前未用任何藥物，移植術(shù)畢，供心升主動脈完全開放前間斷開放15s阻斷15s，共3次。③復(fù)方丹參滴丸處理組，供體每日灌胃1次，連續(xù)7天，復(fù)方丹參滴丸溶于5mL生理鹽水中。④模型對照組，供體于相應(yīng)時間內(nèi)等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，分別處死各組動物，立即取出供心用冰生理鹽水洗滌后置于液氮中保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用Western blot對p53，Bcl-2及Bax蛋白水平進(jìn)行分析，再利用TUNEL染色法及Western blot，對心肌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié) 果

相較于其他3組，復(fù)方丹參滴丸組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Bax、P53蛋白陽性染色指數(shù)、Bcl-2的蛋白陽性表達(dá)較穩(wěn)定，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）單純移植組、缺血后處理組以及模型對照組3組間各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Bax、Bcl-2、P53蛋白陽性表達(dá)比較

5 討 論

缺血再灌注損傷時心肌細(xì)胞由于缺血、缺氧等因素可導(dǎo)致出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，這個過程是在凋亡基因調(diào)控下展開的。Bcl-2/Bax比值在對細(xì)胞凋亡過程介導(dǎo)中有著重要作用［1］。Bcl-2有抑制細(xì)胞凋亡的重要作用，而Bax則可以直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2及Bax都是正負(fù)調(diào)控的凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值影響著細(xì)胞區(qū)域凋亡還是存活問題［2］。近年來，有研究顯示，缺血再灌注損傷時Bcl-2/Bax比值會出現(xiàn)明顯下降。大鼠移植心臟缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax也出現(xiàn)顯著下降，提示移植心臟缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。p53是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)細(xì)胞受損傷及輻射等影響時，p53表達(dá)上調(diào)且直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。Bax與Bcl2同為p53調(diào)控的線粒體凋亡途徑Bcl2蛋白家族成員，單純移植組和模型對照組p53蛋白水平升高，說明p53活化介導(dǎo)的線粒體凋亡通路Bax蛋白高表達(dá)可能是心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的原因之一。復(fù)方丹參滴丸可能通過下調(diào)p53蛋白水平抑制細(xì)胞凋亡信號通路，從而阻斷心肌細(xì)胞凋亡蛋白，降低心肌細(xì)胞凋亡，對心臟功能進(jìn)行保護(hù)［4］。