羊 希,李 霞,余 康,廖學(xué)品,2,3*,石 碧,2,3
(1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院,四川 成都 610065;2.四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610065;3.四川大學(xué) 制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610065)
羽毛是一種豐富的可再生生物質(zhì)資源。據(jù)報道,中國的家禽加工廠每年大約產(chǎn)生幾百萬t的羽毛副產(chǎn)物[1]。羽毛中含有大量的蛋白質(zhì),其中角蛋白是廣泛存在于羽毛中的一種硬性蛋白,該蛋白富含色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸等[2],營養(yǎng)十分豐富。然而,目前羽毛資源并未得到合理有效的利用,大部分作為廢棄物,不僅浪費(fèi)資源,而且有可能造成環(huán)境污染。
傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法降解羽毛會破壞角蛋白中一些必需氨基酸,如甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸等,這類方法不僅生產(chǎn)成本高,而且還會帶來一系列環(huán)境污染問題[3]。相對而言,生物降解廢棄羽毛更加綠色環(huán)保。但羽毛的組成結(jié)構(gòu)特殊,主要由α-角蛋白(α-螺旋)或β-角蛋白(β-折疊)中的多肽鏈緊密堆積而成,其內(nèi)部的半胱氨酸二硫鍵可作為連接橋形成復(fù)雜的交聯(lián)網(wǎng)[4]。因此,羽毛難以被木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等常見的蛋白酶所降解[5]。有研究報道,利用微生物降解羽毛后可以增強(qiáng)羽毛的消化率和可溶性,提高羽毛的利用價值[6]。自然界中可以降解羽毛角蛋白的微生物較多,主要包括細(xì)菌類的芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[7-8]、真菌類的曲霉屬(Aspergillussp.)[9]、放線菌的鏈霉菌屬(Streptomycessp.)[10]。但是采用微生物降解羽毛通常會面臨蛋白酶酶活低和降解羽毛時間長等問題,使得羽毛的利用程度較低,不能得到有效地資源化應(yīng)用。因此,需要尋找和開發(fā)能高效降解羽毛廢棄物的降解菌。
目前,我國對羽毛降解的研究基本停留在角蛋白酶菌的分離、篩選及角蛋白酶作用機(jī)制的初步研究上,而角蛋白酶具有廣闊的應(yīng)用前景使得角蛋白酶倍受關(guān)注。利用羽毛角蛋白酶降解羽毛轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白、多肽和氨基酸來豐富飼料的營養(yǎng)[11];角蛋白酶應(yīng)用于皮革脫毛[12-13];洗滌劑工業(yè)中添加角蛋白酶[14],達(dá)到快速清除血跡的作用;利用角蛋白酶降解羽毛,將有機(jī)氮輸入農(nóng)業(yè)土壤作為重要化肥原料等[15]。
Keratinibaculum paraultunens是從養(yǎng)雞場附近土壤中分離得到的一株厭氧細(xì)菌,具有高效降解角蛋白的能力,可有效打破好氧細(xì)菌降解角蛋白時溶解氧的局限。本研究利用角蛋白降解菌K.paraultunense發(fā)酵雞羽毛,考察了菌株對羽軸、羽枝和羽片的降解特性;探究了不同培養(yǎng)基對該菌發(fā)酵產(chǎn)物的影響;此外,還研究了在羽毛底物不同添加量的情況下該菌的發(fā)酵性能。為進(jìn)一步掌握K.paraultunense對雞羽毛的降解特性及產(chǎn)角蛋白酶、可溶性蛋白特性,以及雞羽毛的綜合利用提供依據(jù)。
1.1.1 菌種
角蛋白降解菌株Keratinibaculum paraultunense:綿陽禾本生物工程有限公司。
1.1.2 雞毛
在當(dāng)?shù)卮笮图仪萃涝讏鍪占u毛,經(jīng)過洗滌劑清洗,自來水反復(fù)沖洗后121℃滅菌30 min,80℃烘干至恒質(zhì)量后,將羽片(the whole feather,C)分為羽軸(feather rachis,A)和羽枝(feather barblues,B)(見圖1),將三者分別用切割研磨機(jī)進(jìn)行粉碎并過25目篩子,密封保存?zhèn)溆谩?/p>
圖1 羽毛的構(gòu)成部分Fig.1 Composition of feathers
1.1.3 化學(xué)試劑
氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、尿素(均為分析純):成都金山化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂(分析純)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(分析純):成都市科龍化工試劑廠;茚三酮(分析純)、考馬斯亮藍(lán)(分析純):成都市科隆化學(xué)品有限公司;牛血清蛋白(純度≥98%):上海伯奧生物科技有限公司。
1.1.4 培養(yǎng)基
全培養(yǎng)基(I)、無機(jī)鹽培養(yǎng)基(II)和純水培養(yǎng)基(III)的組分濃度如表1所示,初始pH值為8.0,培養(yǎng)基分裝到厭氧瓶,厭氧瓶裝液量為100 mL/250 mL。121℃滅菌30 min。
表1 實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of fermentation medium used in the research g/L
SM100切割研磨機(jī):德國萊馳公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;A300型自動氨基酸分析儀:德國MembraPure GmbH公司;HYQX-II厭氧培養(yǎng)箱、HH·B11-BS-II電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。
1.3.1 角蛋白降解菌發(fā)酵廢棄羽毛
將活化好的角蛋白降解菌以1%的接種量接入含有1%羽片的全培養(yǎng)基中,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定較佳的pH值為8.0,溫度為55℃,厭氧培養(yǎng)72 h,在此條件下進(jìn)行發(fā)酵并觀察羽片的降解過程。
1.3.2 羽片降解特性分析
將粉碎后的羽軸、羽枝和羽片分別加入1%于全培養(yǎng)基中,活化好的菌液添加量為1%,55℃培養(yǎng)72 h,每間隔12 h取適量的發(fā)酵液,并將其離心(12 000 r/min、10 min),取上清液,分別測定其游離氨基酸總量、角蛋白酶的酶活力、pH和可溶性蛋白含量,并分析發(fā)酵過程中羽毛降解率的變化。
(1)游離氨基酸的測定
取適量的發(fā)酵液離心,將上清液與10%的磺基水楊酸按4∶1混合均勻,經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后,將過濾液放置于4℃的冰箱冷藏1 h,離心取上清液,用樣品稀釋液稀釋適當(dāng)倍數(shù),最后由0.22μm過濾器再次過濾后上氨基酸分析儀進(jìn)行測定[16]。
(2)角蛋白酶酶活的測定
按照文獻(xiàn)[17]方法略有改進(jìn):以酪蛋白為底物,實(shí)驗(yàn)組取1.5 mL酪蛋白底物(10.0 g/L,pH 7.5)于離心管中,加入1.0 mL粗酶液(發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5 min,上清液即為粗酶液),80℃條件下恒溫水浴反應(yīng)10 min,加10%三氯乙酸1.0 mL終止反應(yīng);對照組取1.0 mL粗酶液于試管中,加入1.0mL10%三氯乙酸,80℃條件下恒溫水浴反應(yīng)10min,反應(yīng)終止時加1.5mL酪蛋白底物。將反應(yīng)產(chǎn)物于12000r/min條件下離心10min,取上清液測定其波長280nm處的吸光度值。
角蛋白酶酶活定義:在pH值為7.5,溫度為80℃的條件下,每1.0 mL酶液反應(yīng)10 min后,A280nm每增加0.01為一個酶活單位(U/mL)。
(3)可溶性蛋白含量的測定
采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定發(fā)酵過程中可溶性蛋白的含量[18],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確配制0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,將5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液與上述牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混合,室溫下反應(yīng)5 min后,測定其在波長595nm處的吸光度值,每組做三個平行實(shí)驗(yàn)。以牛血清蛋白質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制出牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=6.7960x+0.0119 5(相關(guān)系數(shù)R2為0.998),根據(jù)回歸方程,計(jì)算樣品中可溶性蛋白含量。
(4)羽毛降解率的計(jì)算
式中:W1為發(fā)酵前添加的干羽毛質(zhì)量,g;W2為發(fā)酵后未降解羽毛干燥至恒質(zhì)量的殘?jiān)|(zhì)量,g。
1.3.3 不同培養(yǎng)基對羽片降解過程的影響
將10 g/L粉碎的羽片分別加入全培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基和純水培養(yǎng)基中,55℃培養(yǎng)72 h,每間隔12 h取發(fā)酵液離心,測定上清液中游離氨基酸總量、酶活、pH和可溶性蛋白含量,并分析發(fā)酵過程中羽片降解率的變化。
1.3.4 羽片添加量對角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響
將活化好的角蛋白降解菌以5%的接種量分別加入含有10 g/L、50 g/L、100 g/L、150 g/L和200 g/L羽片底物的全培養(yǎng)基中,于55℃條件下培養(yǎng)48 h,測定各發(fā)酵液的角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量,以考察羽片底物的添加量對角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響。
此外,選取含有100 g/L羽片的全培養(yǎng)基為研究對象,接入5%活化好的角蛋白降解菌,于55℃培養(yǎng)84 h,從24 h開始,每12 h取10 mL發(fā)酵液離心,測定上清液中角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量。
1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次,采用SSPS 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用Origin Pro 8.5繪圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,顯著性差異P<0.05。
羽片添加量為10 g/L,活化好的角蛋白降解菌接種量為1%,培養(yǎng)基為表1中的I號培養(yǎng)基,發(fā)酵條件如1.3.1所述。角蛋白降解菌對羽片的降解過程如圖2所示。
由圖2可知,一根完整的羽片在發(fā)酵24 h后,羽枝被完全降解,而羽軸經(jīng)過48 h才被降解完全,可見,羽軸的降解要比羽枝難一些,主要是因?yàn)橛鹬陀疠S的本身的化學(xué)特性存在一定的差異,而且羽軸的比表面積較羽枝小,因此與角蛋白降解菌的接觸面積更少,從而增大了降解的難度[19]。
圖2 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中降解羽片的過程Fig.2 Degradation process of pinna byKeratinibaculum paraultunensein the whole medium
TESFAYE T等[20]對羽軸和羽枝的形態(tài)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)羽軸和羽枝屬于一種蛋白纖維,具有低密度、高柔韌和中空蜂窩結(jié)構(gòu)等特性。將培養(yǎng)基中的羽毛底物設(shè)置為羽軸、羽枝和羽片,這三者的添加量均為10g/L,活化好的角蛋白降解菌接種量為1%,培養(yǎng)基為表1中I號培養(yǎng)基,發(fā)酵條件如1.3.2所述,對羽毛不同部位的降解特性進(jìn)行研究,結(jié)果如圖3所示。羽軸、羽枝和羽片在被K.paraultunense降解時的降解率隨時間的變化如圖3a所示。由圖3a可知,菌株在全培養(yǎng)基中對三者的降解率,羽軸、羽枝和羽片在24 h時就可達(dá)到95%,而三者在36 h羽毛的降解率達(dá)到98%,與未粉碎的羽片(見圖2,36 h時還殘留較多的羽軸)相比,發(fā)酵效率明顯提高??梢?,將羽片進(jìn)行粉碎后,可以在一定的程度上加速羽片的降解,同時,粉碎羽片后,可以減小羽軸和羽枝在降解率上的差距。
角蛋白酶的酶活隨時間的變化結(jié)果如圖3b所示。由圖3b可知,從整體上看,發(fā)酵過程中角蛋白酶的酶活均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,0~12 h角蛋白酶酶活升高緩慢,這可能是此階段的角蛋白降解菌處于適應(yīng)期,從而使得菌株產(chǎn)角蛋白酶較少;在48h時,該菌發(fā)酵羽軸、羽枝和羽片所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活均達(dá)到最高,分別為羽軸5174U/mL、羽枝6 776U/mL和羽片5456U/mL。可見,該菌株不僅對羽片降解率高,所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活也可達(dá)到較高的水平,是一種能高效降解羽片的微生物[21]。
由圖3c和3d可知,可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量隨著發(fā)酵時間增加在不斷積累,在24 h時,含量已達(dá)到最大,隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行,24 h至48 h可溶性蛋白含量基本維持一個穩(wěn)定值,48 h后可溶性蛋白含量開始逐漸下降,而游離氨基酸總量在24 h后逐漸下降。這可能是因?yàn)榫暝?4 h時羽片的降解率接近95%,羽片基本被降解完全,而菌株為維持自身生長代謝需要消耗大量的可溶性蛋白和游離氨基酸,可溶性蛋白的分子量較游離氨基酸大,因此游離氨基酸更易、更快被菌體利用[22]。其中,羽軸在全培養(yǎng)基中產(chǎn)生的游離氨基酸總量最多,而產(chǎn)生的可溶性蛋白含量最低,這可能是由于在羽軸作為底物的培養(yǎng)基中,角蛋白降解菌進(jìn)一步將可溶性蛋白轉(zhuǎn)化為游離氨基酸。這表明,該菌在發(fā)酵羽軸和羽枝產(chǎn)可溶性蛋白和游離氨基酸上是有區(qū)別的,而從整體上看,粉碎后的羽片具備羽枝和羽軸的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羽片經(jīng)過粉碎后,可有效解決羽軸較羽枝難降解這一問題,并且菌株可產(chǎn)生大量的可溶性蛋白和游離氨基酸。
圖3 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中對降解羽軸(A)、羽枝(B)和羽片(C)的影響Fig.3 Effect ofKeratinibaculum paraultunenseon the degradation of pinna rachis(A),barbs(B)and pinna(C)over time in the whole medium
采用表1中的I、II和III三種培養(yǎng)基,選定羽片為發(fā)酵底物,活化好的角蛋白降解菌接種量為1%,其他發(fā)酵條件如1.3.3所述,研究了不同培養(yǎng)基對羽片降解過程的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4a可知,培養(yǎng)基I、II和III中的酶活大小有明顯的差別。其中,III為純水培養(yǎng)基,羽片是微生物發(fā)酵唯一的碳和氮來源,而整個培養(yǎng)階段III中的酶活保持在50U/mL左右,這進(jìn)一步表明該菌株是可以產(chǎn)生角蛋白酶的。但是,與I和II培養(yǎng)基相比,培養(yǎng)基III中的角蛋白酶的酶活是最低的,可見純水培養(yǎng)基不利于該菌株產(chǎn)角蛋白酶。與培養(yǎng)基II相比,培養(yǎng)基I中K.paraultunense所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活較高,且達(dá)到最高酶活時間比II所需時間少,在48 h時,培養(yǎng)基I中K.paraultunense所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活可達(dá)到最大值5 449 U/mL,而II中前24 h酶活都非常低,這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基II中,只含無機(jī)鹽和羽片,因此菌株生長遲緩,需要較長的時間適應(yīng)外部環(huán)境。而培養(yǎng)基I中,除了培養(yǎng)基II所包含的成分外,還添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽和尿素這兩種有機(jī)氮源,可以促進(jìn)這株厭氧型角蛋白降解菌快速生長,增強(qiáng)該菌產(chǎn)角蛋白酶的能力,從而提高該菌的發(fā)酵效率[25]。該菌株接種在培養(yǎng)基I、II和III的產(chǎn)酶能力的順序是培養(yǎng)基I>II>III。
發(fā)酵過程中菌株所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活會直接影響羽片降解率[26]。由圖4b可知,自發(fā)酵開始至24 h,菌株在培養(yǎng)基I和II中羽片降解率不斷增大,24 h以后基本降解,最終羽片降解率在98%左右。但前24h,培養(yǎng)基I中的羽片降解率比II中的高,很可能是菌株在培養(yǎng)基I中有可直接利用碳源和氮源,所以在培養(yǎng)基I中菌株降解羽片比培養(yǎng)基II更快。而在培養(yǎng)基III中菌株降解羽片的最終降解率非常低,在72 h,只有30%的羽片被降解,這表明這株厭氧菌能在純水做培養(yǎng)基的條件下,產(chǎn)生酶和降解部分羽片,進(jìn)一步驗(yàn)證了該菌株具備產(chǎn)角蛋白酶的能力。三種培養(yǎng)基中的羽片降解率由大到小依次為培養(yǎng)基I>II>III。
發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量和游離氨基酸總量隨發(fā)酵時間的延長而變化,結(jié)果見圖4c和4d。由圖4c和4d可知,培養(yǎng)基III中的游離氨基酸總量非常少,而I中的游離氨基酸總量在24h達(dá)到最大值1.06mg/mL,培養(yǎng)基II中的游離氨基酸總量在48 h達(dá)到峰值0.85 mg/mL。由表1可知,培養(yǎng)基II的成本明顯低于I。值得注意的是,雖然培養(yǎng)基I中角蛋白酶的酶活和游離氨基酸的總量整體上要比培養(yǎng)基II中的高,但培養(yǎng)基II中可溶性蛋白達(dá)到的最大含量明顯比I中高,在36 h時,培養(yǎng)基II中可溶性蛋白的含量高達(dá)0.93 mg/mL,而培養(yǎng)基I中最大可溶性蛋白含量是0.69 mg/mL。這可能是在培養(yǎng)基I中,主要以產(chǎn)角蛋白酶為主,其酶活較高,且培養(yǎng)基I中游離氨基酸含量較高;而在培養(yǎng)基II中,主要是以產(chǎn)可溶性蛋白為主,其可溶性蛋白含量高??梢姡到庥鹌倪^程中,培養(yǎng)基的種類對該菌的發(fā)酵性能影響較大,全培養(yǎng)基更適合產(chǎn)角蛋白酶,而無機(jī)鹽培養(yǎng)基更有利于得到高濃度的可溶性蛋白。
圖4 在不同種類的培養(yǎng)基對廢棄羽片降解過程的影響Fig.4 Effect of different medium on degradation process of waste feathers
基于以上的研究,可以發(fā)現(xiàn)該菌株具有高效降解羽片的能力。因此本文考察了羽片底物的添加量對角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響。當(dāng)羽片添加量為10 g/L,活化好的菌液添加量為1%,選擇表1中的I號培養(yǎng)基,其他發(fā)酵條件如1.3.4所述,結(jié)果如圖5所示。
圖5 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h時羽片添加量對角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of feathers addition on keratinase activity and soluble protein contents byKeratinibaculum paraultunense fermented for 48 h in the whole medium
由圖5可知,角蛋白酶的相對酶活力和可溶性蛋白含量隨羽片底物質(zhì)量濃度在0~200 g/L范圍內(nèi)的增加而先增大后降低。其中當(dāng)羽片添加量為50 g/L,酶活達(dá)到最大,為11 520 U/mL;而當(dāng)羽片添加量為100 g/L,可溶性蛋白含量達(dá)到最高為1.58 mg/mL。而當(dāng)羽片底物添加量過高時,角蛋白酶的酶活和可溶性蛋白的含量反而降低。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中羽片濃度過高,會使得發(fā)酵液變得黏稠,影響微生物與營養(yǎng)物質(zhì)之間的傳質(zhì)過程,從而影響角蛋白酶和可溶性蛋白的生成。
當(dāng)羽片添加量為100 g/L時,角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量隨發(fā)酵時間的變化如圖6所示。
圖6 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中發(fā)酵84 h時角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量(a)及降解羽片的過程(b)Fig.6 Keratinase activity and soluble protein content(a),the degradation process of feathers(b)byKeratinibaculum paraultunensefermented for 84 h in the whole medium
由圖6a可知,發(fā)酵48 h得到最大酶活為11 179 U/mL,而發(fā)酵36h得到最大可溶性蛋白含量為1.83mg/mL。與圖4a和4b相比,發(fā)現(xiàn)羽片的添加量和菌種接種量提高到100 g/L和5%時,菌株所產(chǎn)角蛋白酶的酶活和產(chǎn)可溶性蛋白的濃度都提高了兩倍左右。可見,該菌可以利用高濃度的羽片廢棄物,并產(chǎn)生大量的可溶性蛋白和角蛋白酶。此外,不同發(fā)酵時間段的羽片降解情況如圖6b所示。由圖6b可知,即使在羽片濃度較高的條件下,該菌株仍然可以對其高效降解,這表明該菌株可以達(dá)到較大的發(fā)酵負(fù)荷。
角蛋白降解菌(Keratinibaculum paraultunense)在厭氧條件下通過微生物發(fā)酵對廢棄羽片的不同部位進(jìn)行了降解分析,研究發(fā)現(xiàn),羽軸比羽枝更難被降解,羽軸經(jīng)粉碎后,降解效果較好。采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵時,主要降解產(chǎn)物是可溶性蛋白,含量可達(dá)0.93 mg/mL。采用全培養(yǎng)基發(fā)酵時,主要發(fā)酵產(chǎn)物是角蛋白酶和游離氨基酸,當(dāng)羽片底物量提高到100 g/L,角蛋白酶的酶活高達(dá)11 179 U/mL。角蛋白降解菌能快速高效地降解高濃度的廢棄羽片,可生產(chǎn)大量的可溶性蛋白和高活力的角蛋白酶。本研究具有較好的應(yīng)用前景??扇苄缘鞍缀陀坞x氨基酸可豐富飼料營養(yǎng),同時可溶性蛋白作為填充劑應(yīng)用到皮革,能賦予皮革較好的柔軟性和豐滿性,而高活力的角蛋白酶可應(yīng)用到皮革脫毛以及醫(yī)藥等行業(yè)。