肖景惠，張慶芳，于 爽，逄 飛，遲乃玉，王夢雨*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）中重要的氧化還原酶，催化L-蘋果酸脫氫變成草酰乙酸的酶。至今已有多種MDH得到分離純化并獲得晶體結(jié)構(gòu)[1]。根據(jù)MDH亞細胞定位、輔酶特異性以及功能的不同，MDH被分為三大類：第一類是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）-線粒體蘋果酸脫氫酶（mitochondrial malate dehydrogenase，mMDH）類型，主要參與真核微生物線粒體中的三羧酸循環(huán)或乙醛酸循環(huán)；第二類是NAD-胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶（cytosol malate dehydrogenase，cMDH）類型，主要參與原核生物細胞質(zhì)中的TCA循環(huán)或乙醛酸循環(huán)，并且參與真核微生物細胞質(zhì)蘋果酸-天冬氨酸穿梭途徑，負責將細胞質(zhì)中還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的H+傳遞給草酰乙酸，使草酰乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘O果酸[2]。第三類是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）NADP-MDH類型，主要存在于谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）和黃曲霉屬微生物[3]。除以上類別的MDH外，研究發(fā)現(xiàn)古細菌中的MDH對NAD+和NADP+都具有親和力[4]。動力學(xué)特性分析顯示，細胞質(zhì)MDH活性高于線粒體MDH，而線粒體MDH活性高于細胞質(zhì)MDH，且不同細胞器中的MDH有各自不同的生理作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在真核微生物中，MDH只有同源二聚體一種結(jié)構(gòu)形式[6]，但除了部分革蘭氏陽性菌和古細菌中的MDH以四聚體形式存在外[3]，在大部分細菌的MDH以同源二聚體形式存在[7]。

MDH除進行氧能量代謝作用外，還參與C4循環(huán)，糖異生，脂肪酸的氧化，氮同化，氨基酸的合成等各種代謝活動[8]。由于其在多種生化代謝中發(fā)揮作用，MDH廣泛應(yīng)用于心肌梗塞、急性實質(zhì)性肝損傷、肝癌、肺癌的早期診斷，是常用的臨床診斷用酶，并在生物制藥、化工檢測等領(lǐng)域也具有廣泛應(yīng)用。該文介紹了微生物中MDH的蛋白結(jié)構(gòu)、催化機制以及活性調(diào)節(jié)，并對其酶學(xué)性質(zhì)、醫(yī)療診斷及免疫領(lǐng)域的應(yīng)用、工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用以及生產(chǎn)方面，闡述了蘋果酸脫氫酶的研究進展，以期為蘋果酸脫氫酶的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1 微生物蘋果酸脫氫酶的三級結(jié)構(gòu)

研究表明[9]，MDH的氨基酸序列在一級結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出較低的相似性，多數(shù)相似性不到20%。結(jié)合核酸、催化底物以及與亞基的界面結(jié)構(gòu)相關(guān)的幾個功能性結(jié)構(gòu)會由較少的幾個保守的殘基決定。但與較低的氨基酸序列相似不同，原核微生物和真核微生物MDH的晶體結(jié)構(gòu)非常相似[10]，MDH的晶體結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 蘋果酸脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)[9]Fig.1 Three-dimensional structure of malate dehydrogenase

2 微生物蘋果酸脫氫酶的催化機制

酶動力學(xué)研究顯示[11]，MDH所催化L-蘋果酸與草酰乙酸的反應(yīng)過程中，MDH先結(jié)合NAD（H）+，再結(jié)合二羧酸底物蘋果酸或者草酰乙酸。MDH催化蘋果酸羥基的H+定向地結(jié)合到NAD（P）+，實現(xiàn)L-蘋果酸與草酰乙酸二者之間的可逆轉(zhuǎn)換。

不同來源的MDH一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列相似性較低，但輔酶結(jié)合位點、核苷酸結(jié)合位點及催化活性位點高度保守[12]。其中MDH每個亞基的N端為輔酶核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（structurally domain），C端結(jié)構(gòu)域是底物結(jié)合位點和催化位點在內(nèi)的功能域（functionallydomian）。這兩個結(jié)構(gòu)之間的疏水裂縫存在MDH的活性中心，包含了底物和輔酶的結(jié)合位點[8]。當MDH與底物或輔酶在其特異性活性位點通過疏水性結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，MDH空間的改變使得底物能夠被最小化暴露在溶劑中并識別其附近的關(guān)鍵位點。其中三種關(guān)鍵的氨基酸殘基分別為組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg），屬于催化基團。在這個變化過程中，His與Asp結(jié)合形成離子對，位于活性中心，在反應(yīng)過程中提供質(zhì)子，Arg則主要起保護底物的作用[7]。具體機制見圖2。

圖2 蘋果酸脫氫酶的催化機制[13]Fig.2 Catalytic mechanism of malate dehydrogenase

3 MDH活性調(diào)節(jié)

MDH活性受反饋抑制的調(diào)節(jié)，過量的草酰乙酸和NADH強烈抑制MDH活性。SETOYAMA C等[14]研究發(fā)現(xiàn)，來自閃爍古生球菌Archaeoglobus fulgidus，Salinibacter ruber和多糖孢菌Saccharopolyspora erythraea的MDH活性可以被高濃度草酰乙酸所抑制，當紅霉菌在果糖中生長時，MDH活性在培養(yǎng)72 h達到最大值，而MDH在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定。THOMPSON H等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)甲烷古細菌（Methanogenic archaea），嗜熱古細菌（A.fulgidus）和大腸桿菌（Escherichia coli）中，NADH具有相同的抑制作用。此外，碳源的種類也是MDH活性調(diào)節(jié)的因素之一：MOLENAAR D等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌中，MDH的活性均對以淀粉與蔗糖為碳源起反應(yīng)，其中MDHs的活性分別比以葡萄糖為碳源時高3.4倍和3.1倍。在一些微生物中，MDH可與TCA循環(huán)中的其他酶相互作用，來促進底物與底物結(jié)合，從而增加活性。BARTHOLOMAE M等[17]在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中研究發(fā)現(xiàn)，MDH與兩種TCA循環(huán)酶：異檸檬酸脫氫酶和檸檬酸合成酶相互作用，酶活力大幅度提高。

4 微生物蘋果酸脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)

4.1 最適pH值

MDH廣泛存在于自然界生物體內(nèi)，具有較大的pH適應(yīng)范圍，研究顯示在pH2.0～11.5范圍內(nèi)，MDH都具有一定的活性[18-20]。酵母的MDH在pH 8.1的時候酶活力最高，金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）的MDH最適pH一般在9.0左右，在假單胞菌（Pseudomonas）中，MDHs氧化蘋果酸的最適pH為10左右[18]。李倩[19]以大腸桿菌基因組為模板克隆表達的MDH，在pH 2～6的范圍內(nèi)，其酶活比較穩(wěn)定。劉俊[20]從嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）HB27基因組中克隆了MDH的基因，并在大腸桿菌中成功地表達，純化的酶具有pH的偏好性。在堿性環(huán)境中相對較穩(wěn)定，它的最適反應(yīng)pH值為11.5。結(jié)果表明，MDH具有較大的pH適應(yīng)范圍，且不同菌種中MDH的最適pH值具有顯著差異。

4.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

研究表明，大部分的MDH在溫度為37～65℃范圍內(nèi)，都具有一定的活性[11-12]。如深黃被孢霉（Mortierellaisabllina）的MDH在37℃時酶活最高并較為穩(wěn)定[11]；大腸桿菌的MDH的最適反應(yīng)溫度為37℃。MDH在42℃以下較穩(wěn)定，水浴保溫1 h后酶活能保留50%以上[19]；枯草芽孢桿菌的MDH最適溫度約為50℃，但MDH的熱穩(wěn)定性較差，嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）的MDH在65℃有較好的穩(wěn)定性并且酶活最高[12]。在趨向較高或較低溫度時，大多數(shù)種屬的MDH活力都有降低的趨勢。而極端環(huán)境下的微生物在低溫或高溫環(huán)境中依然可以保持較高活力。研究表明[20-21]，MDH的熱穩(wěn)定性與氫鍵數(shù)目、鹽橋數(shù)目以及分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，增加二硫鍵或氫鍵可以改善MDH的熱穩(wěn)定性。如嗜熱細菌Chlorobium tepidum和嗜溫細菌Chlorobium vibrioforme的MDH熱穩(wěn)定存在差異，是由于嗜熱細菌MDH的極性氨基酸殘基在亞基之間形成更多的氫鍵。此外，研究顯示醇類物質(zhì)對MDH的熱穩(wěn)定也有一定程度的影響。在低溫環(huán)境下，甘油可以作為維持MDH活性的優(yōu)良穩(wěn)定試劑。在高溫環(huán)境下，環(huán)多醇和山梨醇能夠有效維持MDH的活性。這可能是由于羥基基團和酶分子的相互作用，從而加強了MDH分子的疏水作用，使MDH受水分子的影響減小，進而提高了其熱穩(wěn)定性。

4.3 金屬離子對MDH影響

通過對大腸桿菌MDH的影響研究表明[22]，不同的金屬離子對MDH活性的影響具有特異性。K+對酶活有明顯的提高作用，F(xiàn)e3+、Co2+和Ni2+對酶活的提高作用次之，Ca2+、Ba2+和Mg2+對酶活影響小。而Pb2+、和Cu2+表現(xiàn)出不同程度的抑制酶活作用，Ag2+、Hg2+和Zn2+對酶活有強烈的抑制作用。尤其需要提到的是，Ag2+和Hg2+抑制水平最強烈，當金屬離子濃度為1 mol/L時，97%的MDH活性受到抑制。對嗜鹽古菌的MDH研究顯示[23]，當電荷密度高時，MDH的折疊結(jié)構(gòu)能被陰離子能有效穩(wěn)定，而在低鹽濃度下，MDH的折疊結(jié)構(gòu)能被陽離子穩(wěn)定，發(fā)揮與前者相同的作用。

5 微生物蘋果酸脫氫酶的應(yīng)用

5.1 醫(yī)療診斷及免疫領(lǐng)域的應(yīng)用

MDH可測定血清中門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性以及血清中總CO2的含量，廣泛用于心肌梗塞，急性實質(zhì)性肝損傷，肝癌，肺癌的早期診斷。MDH作為一種重要的代謝酶，其作用并不局限于代謝調(diào)節(jié)，其還可與p53蛋白相互作用，影響腫瘤細胞周期、衰亡和凋亡[24]。此外，真菌MDH還可作為可篩選抗原表位和靶基因在疫苗開發(fā)和分子生物學(xué)診斷中得到了深入研究。董永亮[25]研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的MDH是免疫原性蛋白，MDH抗體對布魯氏菌入侵細胞有明顯的抑制作用，推測MDH參與了布魯氏菌入侵與黏附宿主細胞過程，這為布魯氏菌相關(guān)診斷、治療藥物及疫苗的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。此外，鐘毅[26]研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌耐藥株MDH蛋白表達量低于敏感菌株，表明其表達水平與菌種耐藥性存在一定關(guān)系，可作為白念珠菌感染人體的特異性檢測靶點。HERNANDO F L等[27]研究發(fā)現(xiàn)，致病念珠菌病人感染血清可與白念珠菌抗原結(jié)合，而在正常人對照中沒有此現(xiàn)象。綜上所述，MDH是一種重要的醫(yī)學(xué)診斷用酶，并且在疫苗研發(fā)和基因檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

5.2 工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

工業(yè)方面，MDH主要可應(yīng)用于發(fā)酵過程中L-蘋果酸、醋酸、檸檬酸的等有機酸的檢測。

5.2.1 定量測定L-蘋果酸

L-蘋果酸廣泛存在于各種酒制品、面包、果汁以及菜蔬制品中，是果酸中的最重要的成分之一。對于葡萄酒和啤酒的釀造工業(yè)中，L-蘋果酸和L-乳酸是兩項極為重要的監(jiān)測指標。在葡萄酒和啤酒的發(fā)酵過程中，需要對發(fā)酵液中的L-蘋果酸含量進行實時監(jiān)測[28]，在生產(chǎn)中，要對發(fā)酵進程進行全程監(jiān)控。

在L-蘋果酸脫氫酶（MDH）的催化作用下，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）氧化L-蘋果酸，隨后生成草酰乙酸，然后在反應(yīng)體系中加入過量的L-谷氨酸，并在谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）的作用下，生成L-天門冬氨酸和2-酮戊二酸。利用上述（1）、（2）式進行偶聯(lián)反應(yīng)，以及在波長340nm處，NADH有特異性的吸收峰的特點，通過測定反應(yīng)體系在波長340 nm處吸光度值的增加值，得到樣品中L-蘋果酸的含量。

5.2.2 定量測定發(fā)酵液中的醋酸[29]

醋酸作為工業(yè)生產(chǎn)中極其重要的影響參數(shù)，廣泛存在于食品、飲料果汁、造紙、制藥等其他工業(yè)產(chǎn)品中。因此，能夠準確測定工業(yè)生產(chǎn)中醋酸的含量是關(guān)鍵。MDH便可以作為輔酶用于對其含量的測定。

在乙酰輔酶A合成酶（acetyl-coenzymesynthetase，ACS）催化作用下，輔酶A催化醋酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA），并生成腺嘌呤核糖核苷酸（adenineribonucleotide，AMP）和焦磷酸，在乙酰輔酶A的作用下，乙酰輔酶A催化草酰乙酸生成檸檬酸，反應(yīng)中的草酰乙酸是由L-蘋果酸與NAD+在L-MDH催化下產(chǎn)生，其中NAD+被還原成NADH，生成的NADH的量與醋酸的量成正比，通過在波長340 nm條件下測定NADH的吸光度值計算醋酸的含量。

5.2.3 定量測定發(fā)酵液中的檸檬酸[30]

檸檬酸是一種常見的酸化劑，歐盟規(guī)定工業(yè)上酸化劑使用濃度的最高上限為1 g/L。同時，檸檬酸也可作為食用香料和防腐劑，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于食品、果汁飲料、肉制品、造紙以及制藥等工業(yè)生產(chǎn)中。此外，檸檬酸也是臨床檢驗的一項重要指標。

在檸檬酸裂解酶（citratelyase，CL）的催化作用下，使檸檬酸生成了草酰乙酸和醋酸。生成的草酰乙酸在L-MDH和NADH的共同作用下，生成L-蘋果酸和NAD+。如果所測樣品中存在草酰乙酸脫羧酶，一部分草酰乙酸在該酶的催化作用下轉(zhuǎn)化生成丙酮酸。為了更加準確的測定檸檬酸的含量，需要使用D-LDH催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為D-乳酸和NAD+，生成的NAD+與檸檬酸的含量成反比，通過在波長340 nm處測定NADH吸光度值變化計算出檸檬酸含量。

6 微生物蘋果酸脫氫酶的生產(chǎn)

微生物由于具有來源廣泛、生長周期短等優(yōu)點，是理想的MDH生產(chǎn)來源?，F(xiàn)階段，研究者一方面通過菌株誘變、優(yōu)化菌株發(fā)酵條件等方法，獲得MDH高產(chǎn)菌株；另一方面，通過基因重組等方法獲得MDH高產(chǎn)菌株，并深入研究MDH的理化特性。BROWN S H等[31]在米曲霉（Aspergillus oryzae）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevusiae）等微生物中，成功地高表達MDH，并發(fā)現(xiàn)其可以提高D-蘋果酸的產(chǎn)量。劉俊[20]從嗜熱菌株HB27中克隆獲得Tt-MDHs基因，并在大腸桿菌中成功表達，并獲得了高純度并具熱穩(wěn)定的MDH蛋白。李倩[19]以大腸桿菌基因組為模板，分子克隆了939bp的MDH基因表達重組菌，獲得比酶活高達112.5U/mg的高產(chǎn)菌株。王俊[6]通過對深黃被孢霉的MDH基因的cDNA序列進行克隆，研究發(fā)現(xiàn)該MDH是一個新的蘋果酸脫氫酶基因，重組蛋白酶活為379.28 U/mg。以上研究工作為微生物MDH產(chǎn)業(yè)化制備提供了大量參考。

7 展望

MDH作為生物體中心代謝途徑的關(guān)鍵酶，在遺傳變異和個體發(fā)育等具有重要的研究價值[25]，并在臨床診斷、工業(yè)檢測具有廣泛應(yīng)用，市場需求量與日俱增，價值巨大。自上世紀50年代，就已經(jīng)有學(xué)者從動物心肌中分離出MDH。現(xiàn)階段，市場上商業(yè)化的MDH來源主要是從豬、兔、牛的心肌、肝臟、骨骼肌中提取。原料成本低、來源廣，但提取工藝繁瑣，產(chǎn)品酶活較低。因此，深入了解微生物MDH的生化特性、結(jié)構(gòu)功能及催化機制，構(gòu)建具有高活力的MDH表達工程菌，優(yōu)化生產(chǎn)菌種發(fā)酵條件具有重要研究意義和應(yīng)用價值。