曲 威， 孫麗英， 江晨潔， 董仁杰， 吳樹彪， 邵 蕾

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東煙臺 264670； 2.小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250000；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京 100125； 4.山東中農(nóng)三月環(huán)保科技股份有限公司，山東煙臺 264000；5.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

沼液是農(nóng)作物秸稈和人、畜禽糞便等原料經(jīng)厭氧發(fā)酵后產(chǎn)生的一種重要的副產(chǎn)物。沼液中含有豐富的可促進(jìn)作物生長、提高作物品質(zhì)的氮、磷、鉀和有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)成分[1-6]；同時含有可添加到動物飼料中的維生素、蛋白酶和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[7]；除此之外，沼液中還含有植物激素、吲哚乙酸、葉枯酸和銨離子等具抑制某些植物病原菌的成分[8-10]。目前，已有研究者進(jìn)行了沼液對番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫病病菌、辣椒綿腐病菌、大豆尖孢鐮刀菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌、瓜果腐霉、茄鐮孢菌、禾谷鐮孢菌等病菌的抑制效果研究，表明沼液對某些植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用[11-14]。

雖然大多數(shù)文獻(xiàn)報道沼液對植物病原菌有抑制作用，但由于沼液的成分受發(fā)酵原料及發(fā)酵工藝等多種因素的影響，不同沼液的成分和特性差異較大，從而導(dǎo)致沼液對農(nóng)作物病害的防治效果結(jié)論缺乏統(tǒng)一性[15-17]。本研究選擇5種農(nóng)作物病原真菌[新月彎孢霉菌(Curvularialunata)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、鏈格孢菌(Alternarianees)、茄鏈格孢菌(Alternariasolani)]進(jìn)行雞場沼液的抑菌作用研究，分別研究了新鮮雞場沼液應(yīng)用不同方法處理后對植物病原真菌菌絲生長的影響和不同貯存時間(貯存15 d和30 d)的雞場沼液對這5種作物病原真菌的抑制效果，為進(jìn)一步研究雞場沼液防病抗菌機(jī)制及沼液應(yīng)用于作物病害防治提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年9—12月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院進(jìn)行。沼液取自山東民和牧業(yè)股份有限公司系統(tǒng)運(yùn)行正常的沼氣發(fā)酵池，主要發(fā)酵原料為雞糞，常溫保存。供試病原真菌包括新月彎孢霉菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌、茄鏈格孢菌，菌種購于中國微生物菌種保藏中心。病原真菌的平板純培養(yǎng)及菌絲生長抑制試驗(yàn)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將5種植物病原真菌在PDA培養(yǎng)基上 25 ℃ 培養(yǎng)6 d左右進(jìn)行活化備用。

1.2.2 沼液處理 無菌條件下將沼液原液加入滅過菌的離心管中，5 000 r/min離心10 min，無菌條件下取沼液上清液分別進(jìn)行以下處理：(1)不作處理沼液，即沼液原液；(2)沼液濾液，離心后上清液在無菌條件下經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌；(3)沼液滅菌，沼液在121 ℃下滅菌20 min。

1.2.3 沼液貯存處理 將沼液在室溫下貯存15 d和30 d，供試驗(yàn)用。

1.2.4 抑菌活性測定 采用平板菌絲生長抑制法進(jìn)行沼液抑菌試驗(yàn)，將滅菌后的培養(yǎng)基在超凈臺上倒入平板，待凝固后，取1 mL上述不同處理的沼液均勻涂布到PDA培養(yǎng)基表面，以1 mL無菌水作空白對照，將直徑為1 cm的圓形菌餅接種到培養(yǎng)基上，每個處理過程中間滅菌30 min，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測量病原真菌菌落直徑。每個處理重復(fù)5次，抑制率計算如下：

抑制率=(對照培養(yǎng)基上菌落直徑-處理培養(yǎng)基上菌落直徑)/對照培養(yǎng)基上菌落直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮雞場沼液對5種農(nóng)作物病原真菌的抑制效果

新月彎孢霉菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌、茄鏈格孢菌5種農(nóng)作物病原真菌在新鮮雞場沼液原液、沼液濾液和沼液滅菌等3種方式處理的培養(yǎng)基上的生長情況(表1)表明，由于農(nóng)作物病原真菌的不同，3種方式處理的雞場沼液的抑制作用有一定差異。

表1 農(nóng)作物病原真菌在新鮮雞場沼液培養(yǎng)基上的生長情況(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：病原真菌長滿培養(yǎng)皿后即停止試驗(yàn)，病原真菌菌落直徑以培養(yǎng)皿直徑9 cm計算。

2.1.1 新鮮雞場沼液原液對5種農(nóng)作物病原真菌的抑制效果 雞場沼液原液對新月彎孢霉菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌、茄鏈格孢菌的菌絲生長抑制率分別為 23.3%～41.1%、25.0%～58.9%、34.4%～72.0%、16.7%～28.3%和14%～39%。沼液原液對灰葡萄孢菌和茄鏈格孢菌的抑制作用持續(xù)增加，6 d的菌絲生長抑制率可達(dá)72%和40%；對新月彎孢霉菌和鏈格孢菌的菌絲生長抑制1 d時最高，隨試驗(yàn)的進(jìn)行抑制率有所下降；對立枯絲核菌的菌絲生長抑制率在3 d時最高，4 d時的抑制率有所下降，立枯絲核菌的抑制試驗(yàn)由于對照病菌長滿整個培養(yǎng)基而終止試驗(yàn)，菌絲生長抑制率在4 d時下降的原因可能是培養(yǎng)基限制了對照組病原菌的生長所致。

2.1.2 新鮮雞場沼液濾液對5種農(nóng)作物病原真菌的抑制效果 雞場沼液無菌膜濾液對新月彎孢霉菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌、茄鏈格孢菌的菌絲生長有一定的抑制作用，抑制率變化范圍分別為3.9%～20.0%、9.1%～27.9%、-1.5%～16.4%、-2.1%～17.5%和20.6%～28.2%，同沼液原液相比沼液濾液對5種病原真菌的抑制作用明顯降低。雞場沼液濾液對新月彎孢霉菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌的菌絲生長抑制作用隨試驗(yàn)進(jìn)行持續(xù)降低，且對鏈格孢菌后期生長中表現(xiàn)出一定的生長刺激作用；對立枯絲核菌的試驗(yàn)維持了5 d，最大抑制率出現(xiàn)在2 d時，但抑制率比沼液原液低 22.4百分點(diǎn)，隨后抑制作用下降；對茄鏈格孢菌的抑制率維持在20%以上。

2.1.3 新鮮雞場沼液滅菌對5種農(nóng)作物病原真菌的抑制效果 雞場沼液滅菌后對5種病原真菌仍有一定的抑制作用，對新月彎孢霉菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的菌絲生長抑制率分別為14.4%～40.6%、8.2%～46.0%、45.4%～70.3%、18.3%～34.5%和20.6%～40.4%，抑制率所表現(xiàn)的變化規(guī)律與沼液原液差異不大，但抑制作用明顯優(yōu)于沼液濾液。對新月彎孢霉菌、立枯絲核菌和鏈格孢菌的最大抑制作用在1 d時，隨后抑制率逐漸下降；對灰葡萄孢菌的抑制作用持續(xù)增加；沼液滅菌對茄鏈格孢菌的抑制作用優(yōu)于沼液原液，6 d時的抑制率達(dá)到40.4%，與沼液原液的抑制率相比增加1.2百分點(diǎn)。

2.2 雞場沼液貯存對5種農(nóng)作物病原真菌的影響

為探究不同貯存時間的雞場沼液對5種農(nóng)作物病原真菌抑制效果的影響，本研究比較了3種方法處理的新鮮沼液和常溫下貯存15、30 d的沼液對5種病原真菌在6 d培養(yǎng)時間內(nèi)的平均抑菌率，結(jié)果見表2。

表2 不同貯存時間雞場沼液對5種作物病原真菌的平均抑制率

注：同一處理同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示處理間差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；立枯絲核菌抑制試驗(yàn)為4 d時的數(shù)據(jù)。

2.2.1 雞場沼液原液貯存對5種農(nóng)作物病原真菌抑制作用的影響 沼液原液對新月彎孢霉菌抑制效果強(qiáng)弱依次為新鮮>貯存30 d>貯存15 d，抑制率分別為33.2%、26.9%、30.3%，經(jīng)方差分析，三者之間無顯著差異，說明隨貯存時間的延長沼液原液對新月彎孢霉菌抑制作用沒有顯著影響；對立枯絲核菌的抑制效果較好，抑制率在40%以上，抑制強(qiáng)弱依次為貯存15 d>貯存30 d>新鮮，方差分析顯示，三者之間無顯著差異，說明沼液貯存對其抑制效果沒有顯著影響；新鮮沼液原液對灰葡萄孢菌抑制率為62.7%，顯著優(yōu)于貯存15 d和貯存30 d的沼液原液抑制率(分別為42.5%和42.7%)。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，沼液原液貯存后對灰葡萄孢菌的抑制作用有下降趨勢；對茄鏈格孢菌的抑制強(qiáng)弱依次為貯存15 d>貯存30 d>新鮮，隨貯存時間的延長抑制率有增高趨勢，方差分析顯示， 貯存15 d沼液原液的抑制率顯著高于其他處理， 因此沼液原液適當(dāng)貯存能夠提高對茄鏈格孢菌的抑制作用；新鮮沼液原液、貯存15 d和30 d沼液原液對鏈格孢菌的抑制率分別為22.8%、31.6%、31.7%，有逐漸增高趨勢，說明貯存時間延長有利于雞場沼液對鏈格孢菌的抑制作用。

2.2.2 雞場沼液濾液貯存對5種農(nóng)作物病原真菌抑制作用的影響 雞場沼液濾液對新月彎孢霉菌和茄鏈格孢菌的抑制規(guī)律相同，抑制效果強(qiáng)弱依次為貯存15 d>貯存30 d>新鮮，但任意兩組之間差異不顯著，因此沼液濾液貯存適當(dāng)時間對新月彎孢霉菌和茄鏈格孢菌的抑菌性沒有顯著影響；沼液濾液對立枯絲核菌和灰葡萄孢菌抑制作用呈現(xiàn)出相同的規(guī)律，抑制效果依次為貯存30 d>貯存15 d>新鮮，說明隨沼液濾液貯存時間延長能夠增強(qiáng)對立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑制效果；新鮮沼液濾液、貯存15 d和30 d沼液濾液對鏈格孢菌的抑制率分別為9.4%、27.0%、24.7%，經(jīng)方差分析，貯存 15 d 沼液濾液抑制率最高，且顯著高于新鮮沼液濾液，說明沼液濾液適當(dāng)貯存一定時間能夠提高對鏈格孢菌的抑制作用。

2.2.3 雞場沼液滅菌貯存對5種農(nóng)作物病原真菌抑制作用的影響 沼液滅菌對新月彎孢霉菌和立枯絲核菌的抑制規(guī)律相同，抑制效果強(qiáng)弱依次為新鮮>貯存15 d>貯存30 d，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，三者之間無顯著差異，說明隨貯存時間的延長沼液滅菌對新月彎孢霉菌和立枯絲核菌的抑制作用沒有顯著影響；新鮮沼液滅菌對灰葡萄孢菌的抑制率為63.6%，抑制作用明顯，但隨貯存時間的延長，貯存15 d和30 d的沼液滅菌對灰葡萄孢菌的抑制率顯著下降；新鮮沼液滅菌、貯存15 d和 30 d 沼液滅菌對茄鏈格孢菌的抑制率分別為30.2%、28.6%、27.8%。經(jīng)方差分析，新鮮沼液滅菌抑制率顯著高于其他2個試驗(yàn)組，說明隨沼液貯存時間的延長沼液滅菌對茄鏈格孢菌的抑制效果顯著下降；沼液滅菌對鏈格孢菌的抑制強(qiáng)弱依次為貯存15 d>貯存30 d>新鮮，方差分析顯示，三者之間無顯著差異，說明隨貯存時間的延長沼液滅菌對鏈格孢菌的抑制效果沒有顯著影響。

3 討論與結(jié)論

沼氣工程迅速發(fā)展[18]，在處理畜禽廢棄物和獲取可再生清潔能源的同時產(chǎn)生大量的發(fā)酵殘留物(即沼渣和沼液)，如不妥善處理，將會對環(huán)境造成“二次污染”，從而制約規(guī)?；託夤こ痰陌l(fā)展。目前，沼液主要用于施肥[4-6]、浸種[19]和添加于飼料中[7]，也有文獻(xiàn)報道沼液對多種農(nóng)作物病原菌有較好的抑制作用[11-14]。本研究以5種農(nóng)作物病原真菌為防治對象，研究雞場沼液對這5種病原真菌生長的抑制作用。結(jié)果表明，新鮮雞場沼液對新月彎孢霉菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、鏈格孢菌和茄鏈格孢菌等5種病原真菌均有抑制作用。

目前，關(guān)于沼液抑菌抗病的機(jī)制存在分歧，有研究者認(rèn)為沼液可以抗病抑菌是由于沼液中含有某些微生物對病原菌的拮抗或競爭作用[12，20]；曹云等認(rèn)為沼液中的銨和腐殖酸是主要的抑菌因子[21]；劉丁才從沼液中分離出具有抑菌作用的8種萜類化合物[22]；陳麗瓊認(rèn)為沼液中有機(jī)酸和NH4+有抑菌作用[23]。本研究中，3種方法處理沼液(沼液原液、沼液濾液和沼液滅菌)對5種病原真菌均有一定抑制作用，并且3種方法處理的雞場沼液的抑菌效果依次為：沼液原液>沼液滅菌>沼液濾液。沼液經(jīng)過濾后，沼液中的大部分微生物和大分子物質(zhì)被截留在濾膜上，而沼液經(jīng)高溫滅菌后，沼液中的微生物被完全去除。因此，可以推測該雞場沼液中具有抗病抑菌功能的主要成分為耐高溫的大分子物質(zhì)，而沼液中有效抑菌成分的分離提取還需要進(jìn)一步研究。

本研究中，雞場沼液隨著貯存時間的延長，沼液原液對新月彎孢霉菌和立枯絲核菌的抑制效果沒有顯著變化，對灰葡萄孢菌的抑制效果減弱，對茄鏈格孢菌的抑制先下降后升高，對鏈格孢菌的抑制效果增強(qiáng)；沼液經(jīng)無菌膜的濾液對新月彎孢霉菌和茄鏈格孢菌的抑制效果無影響，對立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑制作用增強(qiáng)，對鏈格孢菌的抑制作用先升高后下降；沼液高壓滅菌對新月彎孢霉菌、立枯絲核菌和鏈格孢菌的抑制作用無變化，對灰葡萄孢和茄鏈格孢菌的抑制作用減弱。結(jié)果表明，貯存沼液對農(nóng)作物病原真菌的抑制沒有明顯規(guī)律，推測在沼液貯存過程中起抑菌作用的活性物質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致對不同病原真菌的作用有一定的差異性，因此抑菌效果不同。

本研究是實(shí)驗(yàn)室離體條件下的結(jié)果，在田間活體應(yīng)用中，沼液除具有抑制病原菌生長的作用，還可作為肥料提高農(nóng)作物的自身品質(zhì)加強(qiáng)抗病害能力，因此沼液應(yīng)用于田間病害的防治還有待進(jìn)一步研究。