黎月娟 邱長玉 林 強 崔秋英 朱光書 張朝華 吳 凡 朱方容

(1廣西大學農(nóng)學院， 廣西南寧 530004； 2廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站， 廣西南寧 530007)

桑樹(MorusL.)是多年生落葉木本植物，長期以來桑葉主要作為家蠶的飼料，桑椹(桑果)主要用來制作桑椹汁、桑椹酒、桑椹果醬等[1]。為能更好地發(fā)展蠶桑產(chǎn)業(yè)，需要培育優(yōu)良的桑樹新品種，因此了解桑樹的染色體倍性極其重要。經(jīng)過國內(nèi)外學者的長期研究證明，桑屬植物中絕大部分為自然二倍體，但也存在多種自然多倍體[2]。經(jīng)前人的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，中國桑樹有天然三倍體64份、四倍體13份、六倍體66份、八倍體2份、二十二倍體1份[3]，是桑樹多倍體種質(zhì)資源最豐富的國家。

桑樹多倍體表現(xiàn)出一些特殊性狀，如四倍體與其親本二倍體相比，在外形上明顯表現(xiàn)出葉片增大、葉肉增厚、葉色加深、葉脈粗，枝條數(shù)少，長得矮壯等特征[4]。鑒于桑樹多倍體的優(yōu)勢，為了選育既高產(chǎn)桑葉，又高產(chǎn)桑椹的新型品種，王茜齡等[5]培育成果葉兼用人工多倍體桑樹新品種嘉陵30號，該品種是中國第一個通過審定的果葉兼用人工多倍體桑樹新品種[6]。育種專家還育成了多倍體雜交組合粵桑11號[7]、粵桑51號[8]、桂桑5號[9]和特優(yōu)2號[10]等優(yōu)良桑樹品種。在研究桑樹多倍體的時候，發(fā)現(xiàn)了桑樹混倍體現(xiàn)象，何大彥等[11]在觀察桑樹染色體倍性時發(fā)現(xiàn)，在六倍體桑樹品種旺蒼11號、貴州31號內(nèi)有四倍體細胞，在四倍體桑樹品種蘆山3號內(nèi)有二倍體細胞。如果利用染色體計數(shù)的方法來計算混倍體中各個染色體倍性細胞所占的比例極其困難，但是流式細胞術(shù)的出現(xiàn)可以解決該問題。流式細胞術(shù)是一種快速、簡單、能準確地檢測植物染色體倍性的方法[12]，其原理是用染色劑對細胞進行染色，上機檢測，根據(jù)熒光密度與DNA含量成正比，以得到的峰值圖直接反映出不同染色體倍性細胞所占的比例。本次試驗主要利用流式細胞儀對廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站桑樹種質(zhì)資源圃的90份桑樹種質(zhì)資源進行染色體倍性測定，鑒定出二倍體種質(zhì)資源32份、三倍體種質(zhì)資源18份、四倍體種質(zhì)資源30份和混倍體種質(zhì)資源10份，以期為桑樹的多倍體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 桑樹種質(zhì)資源 試驗的所有桑樹種質(zhì)資源均來自廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站桑樹種質(zhì)資源圃。采樣時間為早上8：00—9：00，采樣部位為相同品種的單株不同枝條或不同單株的剛剛展開的嫩葉(采樣的不同主要根據(jù)品種嫩葉量的多少來決定)，每個品種3個重復，每個重復稱取0.25 g材料。對照樣品為二倍體沙2×倫109。

1.1.2 主要試劑 氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)，均為分析純，天津市博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，規(guī)格為100 g，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品； 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，規(guī)格為500 mL，索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；Guava·Cell Cycle Reagent染色劑，規(guī)格為25 mL，美國EMD Millipore corporation公司產(chǎn)品；RNaseA酶，濃度為10 mg/mL，索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 檢測儀器 流式細胞儀，型號為MP-Guava easyCyte HT-2，美國EMD Millipore corporation公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 MgSO4解離液的配制 以配制1 000.0 mL的MgSO4解離液的量進行配制，先在燒杯中裝入800.0 mL超純水，然后依次加入3.70 g的氯化鉀、2.46 g的硫酸鎂、1.19 g的羥乙基哌嗪乙硫磺酸、10.00 g的聚乙烯吡咯烷酮和2.5 mL的聚乙二醇辛基苯基醚，攪拌溶解，用超純水定容至1 000.0 mL，最后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。

1.2.2 90份廣西桑樹種質(zhì)資源染色體的倍性鑒定 參考文獻[13]的方法，稱取0.25 g的新鮮樣品置于平面玻璃板上，加入預冷的1.0 mL MgSO4解離液，用鋒利的刀片快速切碎，轉(zhuǎn)移至預冷培養(yǎng)皿中并混勻，然后于冰上靜置大約5 min，用300目細胞篩網(wǎng)過濾至1.5 mL的EP管中，4 ℃下1 000 r/min 離心4 min，離心漂洗 1次，得到0.5 mL左右的單細胞核懸浮液，然后加入RNaseA酶至最終體積質(zhì)量濃度為 30 μg/mL，然后加入100 μL的染色劑，避光染色30 min，以上操作均在冰上進行。染色完成后用300目細胞篩網(wǎng)過濾，上樣至96孔板，用MP-Guava easyCyte HT-2型流式細胞儀進行檢測，調(diào)節(jié)所需參數(shù)，每個樣品收集分析10 000 個細胞核，分析數(shù)據(jù)，橫坐標表示細胞核DNA 相對含量的熒光強度(RED-A)，縱坐標為細胞核數(shù)量(Count)。以桑樹二倍體品種沙2×倫109作為對照，將待測樣品與之比較，根據(jù)它們之間的關(guān)系，得出相應的桑樹染色體倍數(shù)。每個樣品設(shè)置3組重復。利用Flowjo7.6軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照組染色體的倍性測定

以沙2×倫109作為對照組，檢測調(diào)試電壓時把沙2×倫109的峰值調(diào)到2 000道的位置，如圖1所示，細胞染色體的倍性與細胞核DNA含量呈現(xiàn)一種正比例的關(guān)系，而細胞核的DNA含量又與熒光強度成正比；因此，未知待測樣品根據(jù)對照組的峰值進行判斷，根據(jù)倍性關(guān)系即可得出待測樣品染色體的倍性。每做一批樣本試驗都要用對照組進行調(diào)試，以減少偏鋒現(xiàn)象的出現(xiàn)，減少誤差。

圖1 桑樹品種沙2×倫109染色體倍性的流式細胞儀檢測直方圖

2.2 鑒定組染色體的倍性測定

通過對未知樣品的檢測，根據(jù)對照組的峰值對未知樣品檢測的峰值進行染色體倍性鑒定。下面以92L-17、2182和92L-49等3個桑樹種質(zhì)資源為代表進行具體分析說明，其他桑樹種質(zhì)資源的分析同理。如圖2所示，根據(jù)與對照組的比較，92L-17、2182和92L-49的峰值分別在2 000、3 000和4 000道的位置，由此可判定92L-17、2182和92L-49分別為二倍體、三倍體和四倍體。本次共檢測90份不同的桑樹種質(zhì)資源，通過數(shù)據(jù)分析，如表1、表2所示，二倍體種質(zhì)資源32份，三倍體種質(zhì)資源18份，四倍體種質(zhì)資源30份，混倍體種質(zhì)資源10份?；毂扼w中不同染色體倍性細胞所占的比例可以通過軟件自動分析生成得出具體比例，分析方法如下：首先根據(jù)公式計算未知樣品的G1的平均峰值的比值，即未知樣品的G1的平均峰值的比值=未知樣品的G1的平均峰值/參考標準的G1的平均峰值，然后根據(jù)未知樣品的G1的平均峰值的比值得出染色體倍性。如圖3所示，90-126有2個尖峰出現(xiàn)，其峰值分別在1 500和2 750道的位置，分別為對照組的0.75和1.38倍，符合二倍體和三倍體的特征，由此推斷90-126為二倍體和三倍體的混倍體，其中二倍體細胞占43.2%，三倍體細胞占56.8%。同理，92L-20也有2個尖峰，其峰值分別在2 000和3 600道的位置，分別為對照組的1.00和1.80倍，符合二倍體和四倍體的特征，因此92L-20為二倍體和四倍體的混倍體，其中二倍體細胞占25.9%，四倍體細胞占74.1%。在10份混倍體種質(zhì)資源中有6份為二倍體和三倍體的混倍體，4份為二倍體和四倍體的混合體，具體如表2所示。

圖2 桑樹種質(zhì)資源92L-17、2182和92L-49染色體倍性的流式細胞儀檢測直方圖

表1 80份桑樹種質(zhì)資源染色體倍性鑒定結(jié)果

表2 10份桑樹種質(zhì)資源染色體倍性鑒定結(jié)果

圖3 混倍體桑樹種質(zhì)資源90-126和92L-20染色體倍性的流式細胞儀檢測直方圖

3 小結(jié)與討論

利用流式細胞儀對桑樹染色體的倍性進行檢測，該檢測方法簡便、高效，并且可從較大的細胞群體中檢測出不同染色體倍性細胞的比率，從而可以準確地判斷該植株是否是混倍體。由于桑樹是異花受粉植物，在自然條件下，天然混倍體是比較普遍的；而且，混倍體還可通過屬間嫁接誘發(fā)、化學藥劑誘發(fā)、有性雜交等途徑產(chǎn)生[14]。如魯誘1號就是通過人工誘導產(chǎn)生的混倍體桑樹品種，該品種不僅具有四倍體葉質(zhì)優(yōu)、葉片大、葉肉厚的特點，還具有親本二倍體生長勢旺的特點[15]。在冬棗植物中也發(fā)現(xiàn)了混倍體的存在，并且對其各方面進行調(diào)查與評價，發(fā)現(xiàn)某些性狀也較好，如單果質(zhì)量更大[16]。菜用枸杞新品種天精3號也是人工選育的混倍體品種，是對癭螨免疫、高抗白粉病和根腐病、營養(yǎng)品質(zhì)和藥用品質(zhì)優(yōu)異的品種[17]。由此可知，混倍體具有某些特有的優(yōu)勢，應加以利用。早在1952年關(guān)博夫就發(fā)現(xiàn)混倍體現(xiàn)象，但直到2013年韓莎等才利用流式細胞儀對混倍體進行了檢測，并得到混倍體細胞所占比率的實驗證據(jù)[18]?；毂扼w植株不但含有2種不同染色體倍數(shù)的細胞，還可能含有3種或多種不同染色體倍數(shù)的細胞[14]。對于混倍體，可以加以利用，如通過不斷的分離得到優(yōu)勢個體。

運用流式細胞儀檢測桑樹染色體的倍性時有報道，但其總體檢測的數(shù)量不多，有的是桑樹誘導后，利用流式細胞儀檢測誘導后的染色體倍性[19]，有的是對解離液的選擇和操作過程進行探究[13]，還有的是運用流式細胞儀檢測對桑樹的取材方面影響的分析[18]。而本次試驗主要是根據(jù)前人的研究，利用流式細胞儀對廣西保存的桑樹種質(zhì)資源進行檢測，其檢測數(shù)量較多，并且發(fā)現(xiàn)了部分混倍體，這對桑樹種質(zhì)資源的保存與利用意義重大。

本次試驗在檢測的90份桑樹種質(zhì)資源中就發(fā)現(xiàn)10份混倍體，該結(jié)果跟桑樹混倍體普遍存在符合[14]，并分析了混倍體所含的不同染色體倍數(shù)細胞所占的比率。但本次試驗表2中的桑樹種質(zhì)資源所檢測的倍性有小部分與廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站的專家以前所鑒定的倍性有所不同(未發(fā)表)，分析其原因可能是這些品種是由二倍體誘導育成四倍體，育成的植株可能含有二倍體和四倍體細胞，并且本次檢測距離以前的檢測已隔5年之久，加上多年的剪伐和環(huán)境因素的變化，這些都有可能導致其染色體倍性發(fā)生變化，但其具體原因還需要進一步探究。多倍體育種也是桑樹選育的一種手段，一般四倍體作為育種素材和二倍體培育三倍體，如三倍體湘桑6號就是利用四倍體作為育種素材和二倍體培育而成的[20]。多倍體不但在生產(chǎn)上表現(xiàn)出“多倍體效應”，而且某些多倍體具有較強的抗逆性[21]，因此染色體倍性的鑒定顯得極其重要。通過多倍體誘導，雜交組合等手段對多倍體進行育種，可以選育出不同用途的桑樹品種，如選擇抗性強的桑樹品種應用在生態(tài)景觀方面，選擇桑葉豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的桑樹品種應用在家蠶的飼養(yǎng)上，選擇桑椹豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的桑樹品種應用在食品中，選擇桑葉營養(yǎng)豐富口感好的桑樹品種應用在蔬菜行業(yè)等，豐富桑樹種質(zhì)資源，提高桑樹多倍體的應用范圍。