黃躍偉

（貴州德良方藥業(yè)股份有限公司 貴州 興義 562409）

三七丹參片系由三七和丹參兩味中藥經(jīng)提取加工制成的片劑，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，長(zhǎng)期服用有預(yù)防和治療冠心病、心絞痛的作用[1]。三七丹參片采取高效液相色譜法分別檢測(cè)人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量，通過(guò)計(jì)算兩成份總量來(lái)控制產(chǎn)品的含量[2]。為了進(jìn)一步提高三七丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保臨床患者用藥安全有效，對(duì)三七丹參片中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量測(cè)定進(jìn)行研究，建立三七丹參片中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量測(cè)定方法。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

HP-1100高效液相自動(dòng)進(jìn)樣色譜儀（德國(guó)：包括G1311A四元梯度泵、G1315A二極管陣列檢測(cè)器、HP化學(xué)工作站），CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所）。

1.2 藥物

人參皂苷Rg1對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)110703-200424，中國(guó)藥品生物制品檢定所），人參皂苷Rb1（供含量測(cè)定用，批號(hào)110704-200420，中國(guó)藥品生物制品檢定所），三七皂苷R1對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)110745-200313，中國(guó)藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純），其它試劑均為分析純。三七丹參片5批由貴州德良方藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

2.方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品、供試品以及陰性對(duì)照溶液的制備

精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品和三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg10.4mg、人參皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取0.25g，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲（功率250w，頻率33kHz）處理30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺三七陰性對(duì)照，按照“2.1”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備缺三七陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為 AgiLent HypersiL C18柱（4.0×250mm，5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～ 12分 鐘：A為 9%，B為 81%；12～ 60分 鐘：A為19%→36%，B為81%→64%），流速1ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

按照擬定的色譜條件吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺三七的陰性對(duì)照溶液各10l，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)峰時(shí)處有色譜峰，且與相鄰雜質(zhì)峰充分分離；陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性較好，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照色譜表

2.4 線(xiàn)性關(guān)系

精密稱(chēng)取三七皂苷R1對(duì)照品11.62mg，置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，為三七皂苷R1對(duì)照品儲(chǔ)備液（每1ml 含三七皂苷R1 0.465mg）；精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品24.01mg、人參皂苷Rb1對(duì)照品20.82mg，精密吸取三七皂苷R1對(duì)照品儲(chǔ)備液10ml，置同一25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得每1ml含人參皂苷Rg10.96mg、人參皂苷Rb10.833mg、三七皂苷R1 0.186mg 的混合對(duì)照品溶液。

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋得以下各成分濃度：

（1）人參皂苷Rg1：0.1152mg/ml、0.192mg/ml、0.2304mg/ml、0.384mg/ml、0.48mg/ml、0.96mg/ml。

（2） 人 參 皂 苷 Rb1：99.96μg/ml、166.6mg/ml、199.92μg/ml、333.2μg/ml、416.5μg/ml、833μg/ml。

（3） 三 七 皂 苷 R1：22.32μg/ml、 37.2μg/ml、44.64μg/ml、74.4μg/ml、93μg/ml、186μg/ml。

分別吸取10μl，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定對(duì)照品峰面積，將樣品濃度與峰面積進(jìn)行回歸處理，分別繪制工作曲線(xiàn)，得線(xiàn)性回歸方程為：人參皂苷Rg1，Y=3005X+16.97，R2=0.9995（Y為峰面積，X為進(jìn)樣濃度），進(jìn)樣濃度在0.1152～0.96mg/ml線(xiàn)性關(guān)系良好，人參皂苷Rb1，Y=2374.6X+76.907，R2=0.9996（Y為峰面積，X為進(jìn)樣濃度），進(jìn)樣濃度在99.96～833μg/ml線(xiàn)性關(guān)系良好，三七皂苷R1，Y=2.9385X-0.477，R2=0.9997（Y為峰面積，X為進(jìn)樣濃度），進(jìn)樣濃度在22.32～186μg/ml線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取0.25g，精密稱(chēng)定，照“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，平行制備六個(gè)供試品溶液，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果顯示，供試品取樣量0.25g，人參皂苷Rg1平均含量為13.0714mg/片，RSD為0.51%，人參皂苷Rb1平均含量為11.1827mg/片，RSD為0.63%，三七皂苷R1平均含量為3.0378 mg/片，RSD為0.17，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1混合對(duì)照品溶液10l（每1ml含人參皂苷Rg10.96mg、人參皂苷Rb10.833mg、三七皂苷R1 0.186mg），按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定對(duì)照品溶液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面積，結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液中人參皂苷Rg1平均峰面積為2860.2，RSD為1.27%，人參皂苷Rb1平均峰面積為2072.7，RSD為1.96%，三七皂苷R1平均峰面積545.6，RSD為1.84%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10l，按上述色譜條件，分別在0h、2h、4h、8h、12h、24h進(jìn)樣，測(cè)定供試品溶液中各成分峰面積，結(jié)果顯示，供試品溶液中人參皂苷Rg1平均峰面積為842.15，RSD為1.28%，人參皂苷Rb1平均峰面積為622.85，RSD為1.32%，三七皂苷R1平均峰面積187.88，RSD為1.54%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回性率試驗(yàn)

取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約0.125g，精密稱(chēng)定，置25ml容量瓶中，各精密加入一定體積的人參皂苷Rg1（0.4736mg/ml）、人參皂苷Rb1（0.5732mg/ml）、三七皂苷R1（0.3724mg/ml）對(duì)照品溶液，用70%甲醇定容至刻度，稱(chēng)定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，加入70%甲醇補(bǔ)足減少的重量。搖勻，濾過(guò)，取適量用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，吸取10L續(xù)濾液注入液相色譜儀中進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，回收率（%）=（測(cè)出總量－樣品含量）/對(duì)照品加入量×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 制劑中含人參皂苷Rg10.4mg、人參皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R1含量測(cè)定

隨意抽取三七丹參片留樣產(chǎn)品5批，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照擬定的含量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，5批產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三七丹參片5批留樣產(chǎn)品含量測(cè)定結(jié)果

從表中5批含量測(cè)定數(shù)據(jù)可知，平均含量為27.0514mg/片，擬定含量測(cè)定限度為：本品每片含三七以人參皂苷Rg1（C42H72O14）、人參皂苷Rb1（C54H92O23）和三七皂苷R1（C47H80O18）三者的總量計(jì)，不得少于21.5mg。

3.討論

三七丹參片原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定，采用高效液相色譜法外標(biāo)法分別檢測(cè)人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量，通過(guò)計(jì)算兩成份總量來(lái)控制產(chǎn)品的含量。

由于三七在處方中用藥量較大，為了進(jìn)一步提高三七丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合《中國(guó)藥典》2015年版一部三七項(xiàng)下采用了高效液相色譜法（梯度洗脫）測(cè)定人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[3]，因此，本試驗(yàn)我們以此條件為基礎(chǔ)，對(duì)三七丹參片中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1含量測(cè)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，建立三七丹參片中人參皂苷Rg、人參皂苷Rb和三七皂苷R1的含量測(cè)定方法，以使質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)更趨完善，更有效地控制了三七丹參片的質(zhì)量。