邱若風(fēng), 黃忠平, 王麗麗

(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 杭州 310014)

棉花是一種重要的纖維原料,與大豆、花生、油菜、向日葵共同被列為我國的五大油料作物。文獻(xiàn)[1]報(bào)道棉籽剝殼后的棉籽仁含油量約15%～40%。雖然棉籽中含有棉酚等有毒物質(zhì),但是隨著低酚棉研究的深入和脫酚技術(shù)的發(fā)展,精煉后的棉籽油可以放心食用。

棉籽油含有大量人體必需的脂肪酸,其中不飽和脂肪酸的含量接近70%,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,是一種有益于人體健康的優(yōu)質(zhì)食用油。同時(shí)棉籽油含有多種飽和脂肪酸,可以用作起酥油和人造奶油等[2]。目前,歐美國家限制使用含有反式脂肪酸的氫化植物油,而棉籽油不含反式脂肪酸,可以作為一種天然替代品[3]。同時(shí),棉籽油中的脂肪酸經(jīng)過分離后可以作為工業(yè)原料生產(chǎn)肥皂、潤滑油和甘油等。近年來,隨著人們環(huán)保意識(shí)的提高,棉籽可以作為一種可再生的油料作物,棉籽油可以用來制備生物柴油[4,5]。

我國的棉花產(chǎn)量居世界前列。棉籽作為棉花的一部分,產(chǎn)量很大,如何有效地利用這一資源是我國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)之一。無論是評(píng)價(jià)棉籽油的營養(yǎng)價(jià)值,還是考查棉籽油用作工業(yè)原料的可能性,我們都要研究棉籽油的脂肪酸組成。文獻(xiàn)報(bào)道可采用索氏提取法[6,7]、微波輔助提取法[8]等提取棉籽中的棉籽油。商連光等[6]采用近紅外光譜法直接分析提取后的棉籽油,但該方法不能具體測(cè)定各種脂肪酸的含量。有的文獻(xiàn)[7,8]先將提取到的棉籽油進(jìn)行離線甲酯化,再用氣相色譜-質(zhì)譜法分析甲酯化后的棉籽油。但上述方法均需要大量有機(jī)試劑,前處理步驟耗時(shí)較長。

在線熱輔助甲基化-氣相色譜法是近年來迅速發(fā)展的一種適用于分析有機(jī)酸、多羥基醇、酯類、胺類等物質(zhì)的方法[9]。目前已有采用該方法并以四甲基氫氧化銨為甲基化試劑測(cè)定非正常食用油中脂肪酸組成的報(bào)道[10]。但是棉籽仁中含有較多的不飽和脂肪酸,堿性很強(qiáng)的甲基化試劑會(huì)使多不飽和脂肪酸的雙鍵發(fā)生異構(gòu)化和降解[11],因此在測(cè)定棉籽仁中的脂肪酸時(shí)需要選擇合適的甲基化試劑。

本文采用在線熱輔助甲基化-氣相色譜法對(duì)棉籽仁中的脂肪酸組成進(jìn)行分析,對(duì)影響測(cè)定的主要因素如甲基化試劑、甲基化溫度等進(jìn)行優(yōu)化,旨在建立分析棉籽仁中脂肪酸組成的方法。同時(shí)對(duì)市售食用油中的脂肪酸組成進(jìn)行分析,比較棉籽仁和食用油的脂肪酸組成。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

GC-2010 Plus氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測(cè)器、GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本Shimadzu公司); PY-2020iD微型縱爐裂解器(日本Frontier Lab公司); BP211D分析天平(德國Sartorius公司); SQ-80B超聲振蕩器(中國無錫同建科技有限公司)。

甲醇(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);肉豆蔻酸甲酯(C14∶0)、棕櫚酸甲酯(C16∶0)、棕櫚油酸甲酯(C16∶1)、硬脂酸甲酯(C18∶0)、油酸甲酯(C18∶1)、亞油酸甲酯(C18∶1)、亞麻酸甲酯(C18∶3)、三甲基氫氧化硫(TMSH, 溶于0.2 mol/L甲醇溶液)、四甲基氫氧化銨(TMAH,分析純)購自上海阿拉丁公司。

5組棉籽產(chǎn)地分別為河南安陽(HNAY)、海南三亞(HNSY)、江蘇南京(JSNJ)、浙江金華(ZJJH)、浙江杭州(ZJHZ 1～5);食用油包括花生油、玉米油、葵花籽油。

1.2 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取四甲基氫氧化銨固體,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,超聲溶解,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的四甲基氫氧化銨甲醇溶液,于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

固體樣品:將棉籽去殼后碾碎成粉末,備用。液體樣品:稱取食用油樣品各5 mg,用甲醇定容至1 mL。

如圖1所示,取約0.3 mg固體樣品或1 μL液體樣品,置于樣品杯中,加入2 μL甲基化試劑,將樣品杯固定在進(jìn)樣桿上,裝入裂解器,待儀器穩(wěn)定后,按下進(jìn)樣按鈕,樣品杯迅速落到裂解器的加熱區(qū),樣品中的脂肪酸與甲基化試劑在高溫下瞬間反應(yīng)生成相應(yīng)的甲基化產(chǎn)物,同時(shí)啟動(dòng)氣相色譜儀開始分析。

圖 1 在線熱輔助甲基化-氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of on-line pyrolytic methylation-GC/MS system

1.4 分析條件

色譜柱:DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, 5%苯基-95%聚二甲基硅氧烷);程序升溫條件:初始溫度50 ℃,以10 ℃/min升溫至200 ℃,保持10 min,再以10 ℃/min升溫至300 ℃,保持10 min;汽化室溫度：300 ℃;檢測(cè)器溫度:300 ℃;載氣:高純氮?dú)?分流比100∶1;柱流量:1 mL/min;裂解爐溫度：350 ℃;接口溫度：300 ℃。

離子源:電子轟擊源;離子源溫度:220 ℃;載氣:高純氦氣;傳輸線溫度:270 ℃;電離電壓:70 eV;掃描范圍:m/z50～600。

圖 2 添加(a)TMAH和(b)添加TMSH時(shí)棉籽仁的 甲基化-氣相色譜圖Fig. 2 On-line methylation-GC chromatograms of cottonseed with (a) TMAH and (b) TMSH C18∶2: methyl linoleate; TMAH: tetramethylammonium hydroxide; TMSH: trimethylsulfonium hydroxide.

2 結(jié)果與討論

2.1 在線熱輔助甲基化-氣相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1甲基化試劑的選擇

由于棉籽仁中含有多不飽和脂肪酸,例如亞油酸,為了消除衍生化反應(yīng)對(duì)多不飽和脂肪酸的異構(gòu)化作用,比較了TMAH和TMSH對(duì)脂肪酸的甲基化效果。圖2為棉籽仁在添加TMAH和TMSH條件下得到的在線甲基化-氣相色譜圖。經(jīng)過質(zhì)譜定性可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用TMAH作為甲基化試劑時(shí)可以觀察到亞油酸甲酯的異構(gòu)體,而使用TMSH時(shí)未觀察到亞油酸甲酯的異構(gòu)體。該結(jié)果表明使用TMSH能提高測(cè)定多不飽和組分的靈敏度,同時(shí)不會(huì)降低對(duì)飽和組分的測(cè)定結(jié)果。因此,選擇TMSH作為甲基化試劑。

2.1.2溫度對(duì)甲基化效率的影響

溫度對(duì)在線甲基化反應(yīng)的影響十分明顯,若溫度過低,甲基化反應(yīng)不完全;若溫度過高,三甲基氫氧化硫易發(fā)生分解,會(huì)造成樣品的損失,甲基化反應(yīng)不完全。在300、350和400 ℃溫度下對(duì)0.3 mg棉籽仁粉末進(jìn)行在線熱輔助甲基化-氣相色譜分析,可以看出,不同溫度下硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯的響應(yīng)情況(見圖3)。當(dāng)溫度由300 ℃上升到350 ℃時(shí),3種脂肪酸甲酯的峰面積增大;當(dāng)溫度由350 ℃上升到400 ℃時(shí),3種脂肪酸甲酯的峰面積基本不變。因此,選擇甲基化溫度為350 ℃。

圖 3 溫度對(duì)脂肪酸甲基化效率的影響Fig. 3 Effect of temperature on the methylation efficiency of fatty acids

2.1.3甲基化試劑用量的選擇

甲基化試劑的用量會(huì)影響脂肪酸的甲基化效率。甲基化試劑的用量過少,導(dǎo)致脂肪酸的甲基化反應(yīng)不完全;用量過多,不僅浪費(fèi)試劑,還會(huì)降低脂肪酸的甲基化效率。實(shí)驗(yàn)考察了當(dāng)甲基化試劑用量為1、2和3 μL時(shí)0.3 mg棉籽仁中3種脂肪酸的甲基化效率(見圖4)?？梢钥闯?隨著甲基化試劑用量的增加,飽和脂肪酸硬脂酸的甲基化效率有所增加,而不飽和脂肪酸油酸和亞油酸的甲基化效率下降?？赡苁且?yàn)樵诟邷亍A性較高的環(huán)境中目標(biāo)物發(fā)生異構(gòu)化或者分解。因此,選擇甲基化試劑的用量為2 μL。

2.2 棉籽仁中脂肪酸組成的測(cè)定

棉籽仁中脂肪酸的定性采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)照結(jié)合質(zhì)譜定性。8種脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜特征離子見表1。圖5為不同產(chǎn)地的棉籽仁的在線甲基化-氣相色譜圖。從圖中可以看出,8種脂肪酸甲酯得到較好分離,分別為肉豆蔻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生酸和二十二酸。采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量,計(jì)算棉籽仁中各種脂肪酸的含量,其脂肪酸組成見表2(花生酸與二十二酸含量較低,未進(jìn)行定量計(jì)算)。

圖 4 TMSH用量對(duì)脂肪酸甲基化效率的影響Fig. 4 Effect of the volume of TMSH on the methylation efficiency of fatty acidsC18∶0: methyl stearate; C18∶1: methyl oleate.

No.Retention time/minFatty acid methyl esterCharacteristic ions (m/z)116.25methyl myristate (C14∶0)74, 199, 211, 242219.45methyl palmitoleate (C16∶1)55, 194, 236, 268319.91methyl palmitate (C16∶0)74, 227, 239, 270425.24methyl linoleate67, 220, 263, 294525.44methyl oleate55, 222, 264, 296626.24methyl stearate74, 255, 267, 298730.32methyl arachidate (C20∶0)74, 283, 295, 326832.88methyl docosanoate (C22∶0)74, 311, 323, 354

圖 5 棉籽仁的在線甲基化-氣相色譜圖Fig. 5 On-line methylation-GC chromatograms of cottonseed HNAY: Henan Anyang; JSNJ: Jiangsu Nanjing; HNSY: Hainan Sanya; ZJJH: Zhejiang Jinhua; ZJHZ: Zhejiang Hangzhou.

2.3 食用油中脂肪酸組成的測(cè)定

食用油中脂肪酸的定性采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)照結(jié)合質(zhì)譜定性。圖6為3種食用油的在線甲基化-氣相色譜圖。從圖中可以看出,8種脂肪酸甲酯得到較好分離,分別為肉豆蔻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸花生酸和二十二酸。采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量,計(jì)算食用油中各種脂肪酸的含量,其脂肪酸組成見表2(玉米油和葵花籽油中花生酸與二十二酸含量較低,未進(jìn)行定量計(jì)算)。

圖 6 3種食用油的在線甲基化-氣相色譜圖Fig. 6 On-line methylation-GC chromatograms of three kinds of edible oils

2.4 棉籽仁與食用油中脂肪酸組成的比較

由表2可知,9個(gè)棉籽仁樣品中亞油酸的含量為43.20%～53.61%,棕櫚酸的含量為24.15%～27.30%,油酸的含量為16.51%～27.00%,硬脂酸的含量為2.32%～5.29%,肉豆蔻酸的含量為0.85%～1.11%,棕櫚油酸的含量為0.42%～0.85%。這與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的基本一致。

棉籽仁中的不飽和脂肪酸有棕櫚油酸、油酸、亞油酸,占脂肪酸總含量的66.30%～72.54%，其中油酸的相對(duì)含量為16.51%～27.00%,亞油酸的相對(duì)含量為43.20%～53.61%。研究[13,14]表明,油酸和亞油酸通過參與人體的各種生理過程,起到降低血壓、血脂的作用,具有預(yù)防心腦血管疾病的功效。

棉籽仁中含有的飽和脂肪酸主要有肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸,占總脂肪酸相對(duì)含量的27.46%～33.70%，其中棕櫚酸的相對(duì)含量為24.15%～27.30%。研究[15]表明,棕櫚酸不易氧化,具有良好的起酥性和穩(wěn)定性,可用于食品制造業(yè)。文獻(xiàn)[4]報(bào)道,以棉籽油為原料制備的生物柴油具有十六烷值高、可再生等優(yōu)點(diǎn)。

為了分析不同產(chǎn)地棉籽仁中脂肪酸組成的差異,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行相似性分析。由相似矩陣可知,5個(gè)產(chǎn)地的9個(gè)棉籽仁樣品之間的相似度均大于0.974,說明5個(gè)產(chǎn)地的9個(gè)棉籽仁樣品的脂肪酸相對(duì)含量差異不明顯,因此在棉籽油的開發(fā)和利用過程中無需考慮不同品種和地區(qū)之間差異性的影響。

表 2 不同產(chǎn)地棉籽仁與食用油中脂肪酸的相對(duì)含量

-: no data.

圖 7 9個(gè)棉籽仁樣品和8個(gè)食用油樣品的主成分分析Fig. 7 Principal component analysis of the nine cottonseed samples and eight edible oil samples

圖 8 9個(gè)棉籽仁樣品和8個(gè)食用油樣品的系統(tǒng)聚類分析Fig. 8 Hierarchical cluster analysis of the nine cottonseed samples and eight edible oil samples

為了比較棉籽仁與食用油中脂肪酸組成的差異,將表2的峰面積百分含量輸入SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,調(diào)用因子分析模塊進(jìn)行主成分分析。圖7為提取兩個(gè)主成分得到的9個(gè)棉籽仁樣品和8個(gè)食用油樣品的主成分分析圖。由圖7可見,棉籽仁聚成一組,與3種食用油明顯區(qū)分開來。

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析。圖8為9個(gè)棉籽仁樣品和8個(gè)食用油樣品的系統(tǒng)聚類分析樹狀圖,更直觀地顯示了樣品逐步合并的過程。橫坐標(biāo)為臨界值,即類間的距離,縱坐標(biāo)為樣品名稱。臨界值越小,表示譜圖越相似。當(dāng)臨界值小于10時(shí),棉籽仁與玉米油、葵花籽油聚為一類，表明棉籽仁中的脂肪酸組成和玉米油、葵花籽油相似。在相似性分析中，棉籽仁中的脂肪酸組成與玉米油的相似度為0.960～0.992。

以上結(jié)果表明,棉籽油作為食用油具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,如果將棉籽油中的脂肪酸進(jìn)行分離可用作工業(yè)原料。

3 結(jié)論

建立了測(cè)定棉籽仁中脂肪酸組成的在線熱輔助甲基化-氣相色譜法。利用建立的方法對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的棉籽仁和3種食用油的脂肪酸組成進(jìn)行分析,結(jié)果表明，不同產(chǎn)地棉籽仁的脂肪酸組成差異不明顯,且棉籽仁的脂肪酸組成與玉米油最為接近。棉籽油作為食用油具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,如果將棉籽油中的脂肪酸進(jìn)行分離可用作工業(yè)原料。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確,適合分析棉籽仁和食用油中的脂肪酸組成。