蔣德意

(潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700)

乳酸菌是人體正常菌群之一，具有平衡腸道環(huán)境、提高免疫力、抗腫瘤、維持心血管健康等重要生理功能，與人體健康息息相關(guān)[1-3]。嗜酸乳桿菌以較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽特性成為乳酸菌家族中極為重視研究和開(kāi)發(fā)的益生菌，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品和微生態(tài)制劑[4]。乳酸菌的生理功能是否能在人體中體現(xiàn)出來(lái)，除了與其能否順利到達(dá)腸道有關(guān)外，還與其是否能定植在腸道中有很大關(guān)系。因此本文研究嗜酸乳桿菌LA-G80在腸道中的定植能力，為以后的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

嗜酸乳桿菌LA-G80（L. acidophilus LA-G80），由潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司菌種保藏中心保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，保持溫度（22±2）℃，濕度（56±5）%，每3天換1次鋸末。控制12 h光照，12 h黑暗的循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)，每天上午7點(diǎn)開(kāi)燈。實(shí)驗(yàn)大鼠在試驗(yàn)期間給予自由飲水和自由采食，體重每3天檢測(cè)一次。在進(jìn)行試驗(yàn)前，均先給予1周的適應(yīng)期，適應(yīng)期內(nèi)飼喂基礎(chǔ)飼料[5-6]。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；糞便基因組DNA試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品為在潔凈環(huán)境下生產(chǎn)的嗜酸乳桿菌LA-G80粉末，淺黃色，鋁箔袋包裝。

1.2 方法

1.2.1 灌胃液制備

用生理鹽水稀釋樣品至所需的菌濃度，實(shí)驗(yàn)高劑量組1.0×1010CFU/mL，實(shí)驗(yàn)低劑量組5.0×108CFU/mL，對(duì)照組為生理鹽水。

1.2.2 大鼠灌胃

實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組，每組15只大鼠，按1 mL/100 g（菌液體積/鼠體重）灌胃，每天早上9點(diǎn)定量灌胃1次，連續(xù)灌胃7天。灌胃期間除定點(diǎn)灌胃外，正常飼喂常規(guī)飼料。于灌胃階段的初始，停止灌胃1天、3天、5天、7天、9天和11天采集大鼠糞便，裝于無(wú)菌5 mL EP管中，于-40 ℃保存。

1.2.3 嗜酸乳桿菌LA-G80的特異性引物設(shè)計(jì)

提取嗜酸乳桿菌LA-G80的全基因組，采用上海生工生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒抽提。提取后的基因組經(jīng)16S rRNA鑒定[7]是嗜酸乳桿菌LA-G80無(wú)誤。

使用引物 p514（5'-TGGATCACCTCCTTTCTA-3'）和 p675（5'-GTGCGCCCTTTATTAACTT-3'）[8-9]對(duì)全基因組ISR區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 30 s，45 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸電泳膠驗(yàn)證，將PCR產(chǎn)物大片段進(jìn)行膠回收，并將純化回收后的片段序列進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)定得到的片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，選定差異性最大的區(qū)域作為種特異性片段，嗜酸乳桿菌LA-G80種特異性片段長(zhǎng)度為500 bp，并根據(jù)菌的同特異性片段設(shè)計(jì)種特異性引物。

1.2.4 外標(biāo)準(zhǔn)品制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

同時(shí)將種特異性片段與pEasy-T1 Simple質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)過(guò)菌落PCR驗(yàn)證，提取質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)品，并通過(guò)Real-time quantitative PCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 Real-time quantitativePCR測(cè)定糞便中菌含量

采用天根生化科技公司糞便基因組DNA試劑盒抽取糞便中的全基因組。將待測(cè)糞便樣品DNA抽提液按與制備標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行Real-time quantitative PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行溶解曲線分析，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增曲線與靈敏度測(cè)定

圖1為不同濃度嗜酸乳桿菌LA-G80作Realtime PCR后顯示的熒光定量擴(kuò)增曲線。可以看出，不同拷貝數(shù)的模板隨循環(huán)數(shù)的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在經(jīng)過(guò)指數(shù)擴(kuò)增期后曲線趨于平行，即出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)，指數(shù)擴(kuò)增期模板拷貝數(shù)與熒光累積值的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系形成了嗜酸乳桿菌LA-G80定量的基礎(chǔ)。從擴(kuò)增曲線圖可見(jiàn)少至100個(gè)菌仍有特征性曲線生長(zhǎng)，說(shuō)明該Real-time PCR具有較好的靈敏度。

圖1 嗜酸乳桿菌LA-G80 l06～102拷貝的模板循數(shù)與熒光強(qiáng)度關(guān)系圖

2.2 嗜酸乳桿菌LA-G80標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)得到嗜酸乳桿菌LA-G80的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，為待測(cè)樣品的嗜酸乳桿菌LA-G80定量提供了參照標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采集了5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 嗜酸乳桿菌LA-G80標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 溶解曲線與假陽(yáng)性

模板在熒光定量PCR反應(yīng)的后期，產(chǎn)物經(jīng)溶解、冷卻后得到溶解曲線如圖3，可見(jiàn)溶解曲線成單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，與SYBR GreenⅠ熒光染料結(jié)合的為目標(biāo)DNA片斷，該反應(yīng)條件較好地避免了定量檢測(cè)過(guò)程中假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

圖3 擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線

2.4 大鼠糞便中嗜酸乳桿菌LA-G80定量結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組大鼠糞便內(nèi)嗜酸乳桿菌LA-G80定量結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，灌胃生理鹽水的對(duì)照組其檢出的嗜酸乳桿菌LA-G80含量隨時(shí)間變化很小，這很好地說(shuō)明了設(shè)計(jì)的種特異性引物的特異性良好，并表明此種檢驗(yàn)方法的有效性良好。灌胃菌液的糞便樣品中都有檢出嗜酸乳桿菌LA-G80的存在，灌胃高劑量組菌液大鼠的糞便中菌含量比灌胃低劑量組菌液大鼠糞便中菌含量要高一個(gè)數(shù)量級(jí)，這與灌胃液高劑量組比低劑量組菌濃高相符合。

圖4 嗜酸乳桿菌LA-G80定植能力

如圖4所示，在停止灌胃1天后，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量均達(dá)到最高值，且與各灌胃劑量相符合。隨著停止灌胃后時(shí)間的延長(zhǎng)，糞便樣品中菌含量總體上呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。在停止灌胃3天時(shí)，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80比初始灌胃劑量降低2個(gè)數(shù)量級(jí)。在停止灌胃3～5天時(shí)，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量降低很小，基本保持穩(wěn)定，且在停止灌胃7天時(shí)，僅下降1個(gè)數(shù)量級(jí)，仍可保持約105CFU/g，直到停止灌胃9天后菌含量才降至對(duì)照組水平。

3 結(jié)論

通過(guò)灌胃大鼠，采集不同停止灌胃后時(shí)間的大鼠糞便，并應(yīng)用Real-time PCR方法快速、準(zhǔn)確地對(duì)糞便樣品進(jìn)行嗜酸乳桿菌LA-G80的定量，從而研究了嗜酸乳桿菌LA-G80的腸道定植能力。研究發(fā)現(xiàn)在停止灌胃1天后，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量達(dá)到最高值，且與各灌胃劑量相符合。在停止灌胃3～5天時(shí)，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量降低很小，基本保持穩(wěn)定，且在停止灌胃7天時(shí)，僅下降1個(gè)數(shù)量級(jí)，仍可保持約105CFU/g，直到停止灌胃9天后菌含量才降至對(duì)照組水平，說(shuō)明嗜酸乳桿菌LA-G80有較好的腸道定植能力，且定植時(shí)間約為9天。這可能是由于嗜酸乳桿菌LA-G80本來(lái)自于腸道，且對(duì)酸有良好的耐受性，而乳酸菌在腸道中定植的首要條件是穿過(guò)胃部并保持較大的活菌數(shù)，進(jìn)而在小腸定植，胃部的強(qiáng)酸環(huán)境會(huì)使不耐酸的乳酸菌大量死亡，而嗜酸乳桿菌LA-G80的良好酸耐受性可使其在進(jìn)入胃部后仍能保持高存活率，并保持高活菌數(shù)進(jìn)入小腸，進(jìn)而在小腸定植，發(fā)揮益生功能。