邵珊珊, 李發(fā)麗, 陳昕鈺，董召娣，余徐潤(rùn), 熊 飛

(揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

大麥穎果由果皮、種皮、胚和胚乳四部分組成。大麥的食用部分主要為胚乳，淀粉含量占胚乳貯藏物質(zhì)的90%以上[1]，是大麥主要的貯藏物質(zhì)。糯大麥支鏈淀粉含量高，表現(xiàn)出獨(dú)特的淀粉品質(zhì)性狀，在食用加工、釀造及畜牧產(chǎn)業(yè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。淀粉約占籽粒重量的60%～75%，其中直鏈淀粉含量變化范圍在0～45%之間，淀粉總含量及直鏈淀粉含量的高低對(duì)大麥的最終品質(zhì)有重要影響[2-3]，而胚乳淀粉體的發(fā)育和充實(shí)狀況對(duì)糯大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]起決定作用。淀粉體由原質(zhì)體發(fā)育而來(lái)，是主要用來(lái)合成和貯藏淀粉的一種重要細(xì)胞器[5]。近年來(lái)學(xué)者們不乏對(duì)糯大麥的研究，李祥棟等認(rèn)為糯性大麥因其支鏈淀粉含量多，具有高黏性、耐蒸煮、延展性優(yōu)等特性，在食品加工和釀造產(chǎn)業(yè)上都有廣泛的應(yīng)用[6]。研究者們對(duì)大麥穎果內(nèi)胚乳淀粉體的研究更是不少，Berger等[7]、荊彥平等[8]指出，在谷物胚乳淀粉體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞核衰亡并降解，胚乳細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞程序性死亡的特征，然而胚乳細(xì)胞中的淀粉體仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和增殖，最終充實(shí)整個(gè)胚乳細(xì)胞。Van Dongen[9]和劉美等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在大麥的生長(zhǎng)過(guò)程中，胚乳中的淀粉、蛋白質(zhì)等儲(chǔ)藏物質(zhì)為大麥種子的萌發(fā)和幼苗的早期生長(zhǎng)提供了必要的能量供應(yīng)。

盡管大麥淀粉研究的深入程度不及玉米、小麥和水稻，但由于近年來(lái)大麥淀粉在食品和工業(yè)應(yīng)用中作為其他淀粉的替代物而使其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值日益顯現(xiàn)[11-12]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于糯大麥的研究主要集中于大麥淀粉的理化性質(zhì)方面，而對(duì)糯大麥穎果發(fā)育過(guò)程研究較少。該研究以糯大麥代表品種‘白青稞’、‘甘墾5號(hào)’與非糯大麥代表性品種‘揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)’、‘蘇裸麥1號(hào)’為材料，采用體視顯微鏡觀察、組織化學(xué)染色、樹(shù)脂半薄切片和光學(xué)顯微鏡觀察等方法比較糯大麥與非糯大麥穎果及胚乳淀粉體發(fā)育的特點(diǎn)，探討糯大麥與非糯大麥穎果發(fā)育的差異機(jī)理，為糯大麥淀粉的食品加工、應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究選用2個(gè)糯大麥和2個(gè)非糯大麥代表性品種為試驗(yàn)材料。糯大麥品種‘白青稞’(C2-2)，是西藏自治區(qū)邊壩縣農(nóng)技站從農(nóng)家品種系統(tǒng)選育而來(lái)。此品種穗大粒多，適應(yīng)性強(qiáng)，穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)，性能好；‘甘墾5號(hào)’(GK5)，為甘肅省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)研究院選育的黑色食用糯大麥新品種，加工品質(zhì)較好。非糯大麥品種‘揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)’(YNP10)，由‘蘇引麥3號(hào)’和‘揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)’雜交而來(lái),具有籽粒和麥芽品質(zhì)優(yōu)良的優(yōu)點(diǎn)；‘蘇裸麥1號(hào)’(SLM1)，為江蘇沿江地區(qū)農(nóng)科所采用優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗種質(zhì)親本雜交選育而成的裸大麥新品種，具耐肥抗倒性較好, 成穗率較高的優(yōu)點(diǎn)。以上材料均由揚(yáng)州大學(xué)大麥研究中心提供。所有大麥材料于2016年10月種植于揚(yáng)州大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田，常規(guī)管理，保證正常生長(zhǎng)。

1.2 方 法

1.2.1標(biāo)花和掛牌對(duì)于開(kāi)穎的大麥品種，在開(kāi)花期采用記號(hào)筆點(diǎn)開(kāi)穎穎花與植株上掛牌相結(jié)合的方法來(lái)標(biāo)記穎花的開(kāi)花日期；對(duì)于閉穎的大麥品種，于齊穗期同一天，進(jìn)行掛牌來(lái)標(biāo)記穗莖露出劍葉鞘的時(shí)間，直至花期結(jié)束。

1.2.2穎果形態(tài)觀察及組織化學(xué)染色(1) 穎果形態(tài)觀察：取不同發(fā)育天數(shù)的大麥穎果，于體視顯微鏡(MZ6型，德國(guó)Leica公司)下觀察并拍照，觀察物質(zhì)積累及發(fā)育情況。(2) I2/KI染色：將不同發(fā)育天數(shù)的大麥穎果用刀片縱剖，室溫下用I2/KI(0.3%I2+1%KI)染色6～10 s，后置于體視顯微鏡下觀察穎果剖面著色情況。I2/KI可將含有淀粉的地方染色，支鏈淀粉被染成紅褐色，而直鏈淀粉被染成藍(lán)黑色，通過(guò)觀察剖面著色情況可判斷淀粉的積累情況。

1.2.3大麥穎果生理指標(biāo)的測(cè)定對(duì)不同發(fā)育天數(shù)的大麥穎果進(jìn)行采集，稱量穎果百粒鮮重，再于105 ℃下殺青30 min，80 ℃下烘干至恒重后，稱量穎果百粒干重，并計(jì)算穎果含水率。將上述烘干的穎果充分研磨，采用蒽酮比色法[13]及高氯酸法[14]分別測(cè)定穎果的可溶性糖含量和總淀粉含量。

1.2.4胚乳顯微結(jié)構(gòu)觀察(1) 胚乳不同部位淀粉體發(fā)育顯微觀察：取不同發(fā)育天數(shù)的大麥穎果，用刀片將要觀察的部位切成2 mm厚的薄片，放入2.5%戊二醛前固定液中于4 ℃下固定4 h，后經(jīng)磷酸緩沖液(pH 7.2)清洗、乙醇系列脫水、環(huán)氧丙烷置換、低粘性Spurr樹(shù)脂浸透與包埋，70 ℃下聚合成樹(shù)脂樣品塊。用超薄切片機(jī)(Ultracut R型，德國(guó)Leica公司)制作1 μm厚的薄片，經(jīng)0.5%甲基紫和1%番紅染液復(fù)染色后于光學(xué)顯微鏡(DMLS型，德國(guó)Leica公司)下觀察并拍照，對(duì)大麥穎果背、腹部胚乳淀粉體的發(fā)育進(jìn)行比較和分析。(2) 胚乳淀粉體形態(tài)、面積的測(cè)定：參照余徐潤(rùn)等[15]的方法，運(yùn)用Image-Pro Plus和Adobe Photoshop CC 2017軟件對(duì)胚乳淀粉體的大小和淀粉體占胚乳細(xì)胞的面積比的變化進(jìn)行分析。

1.2.5表觀直鏈淀粉含量測(cè)定參照朱帆等[16]的方法，采用碘結(jié)合法測(cè)定表觀直鏈淀粉含量。

1.2.6數(shù)據(jù)分析各指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 19.0軟件處理，用Origin 9.0作圖，圖片用Adobe Photoshop CC 2017做拼圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥穎果發(fā)育過(guò)程中形態(tài)的變化

大麥穎果在發(fā)育過(guò)程中大小、形狀和色澤均發(fā)生了變化(圖1)。每種大麥穎果均在花后1～11 d，體積由小而大，主要變化為縱向變長(zhǎng)，穎果表面色澤由乳白色變?yōu)闇\綠色；在花后13～23 d，穎果體積不斷增大，但縱向幾乎不再變化，主要為橫向加粗，穎果表面色澤逐漸變?yōu)樯罹G色；在花后25～40 d，穎果基本成型，果皮顏色逐漸變?yōu)樽攸S色，最后變?yōu)樯钭厣Ｆ渲?，花?5～40 d期間，‘甘墾5號(hào)’穎果表面色澤變化最大，逐漸變黃發(fā)黑，花后40 d時(shí)完全變?yōu)榛液谏?；而其他品種則為深棕黃色。在穎果的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，糯大麥和非糯大麥穎果大小、形狀和表面色澤等方面的變化具有一定相似的規(guī)律。

YNP10. 揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)，非糯大麥；SLM1. 蘇裸麥1號(hào)，非糯大麥；C2-2. 白青稞，糯大麥； GK5. 甘墾5號(hào)，糯大麥;圖中數(shù)字表示穎果發(fā)育天數(shù);下同圖1 4種大麥穎果在發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化YNP10.Yangnongpi 10，non-waxy barley； SLM1.Suluomai 1, non-waxy barley； C2-2.Baiqingke, waxy barley； GK5.Ganken 5, waxy barley; Number of the figure show development days of caryopsis. The same as belowFig.1 Morphologic changes during the development of caryopsis of four barley cultivars

圖2 不同發(fā)育天數(shù)大麥穎果縱切面I2/KI染色Fig.2 The I2-KI dyeing of barley caryopsis vertical section at different development days

2.2 大麥穎果發(fā)育過(guò)程中淀粉積累的變化

在穎果發(fā)育前期，大麥胚乳不能被染色，果皮部分可被染成藍(lán)黑色，可知此時(shí)果皮中已經(jīng)含一定量的直鏈淀粉(圖2)。在花后7 d，胚乳部分開(kāi)始被染色，且隨著胚乳細(xì)胞的發(fā)育，染色面積逐漸增大，染色程度逐漸加深；而在此過(guò)程中，果皮的著色程度逐漸變淺，直至不著色，說(shuō)明果皮中的淀粉在逐漸降解。另外，糯大麥與非糯大麥穎果胚乳和果皮的I2/KI染色結(jié)果不同：非糯大麥胚乳被I2/KI染成藍(lán)黑色，糯大麥胚乳則被染成紅褐色，但二者果皮染色特性一致，均呈藍(lán)黑色(圖2)。

圖3 大麥穎果在發(fā)育過(guò)程中鮮、干重及含水率的變化Fig.3 Changes of fresh and dry weight and moisture content during the development of barley caryopsis

2.3 大麥發(fā)育過(guò)程中穎果鮮、干重和含水量的變化

從圖3可看出，糯大麥和非糯大麥在發(fā)育過(guò)程中，穎果鮮、干重變化趨勢(shì)大體一致，生長(zhǎng)曲線均呈“S”型。各品種穎果鮮重在花后3～27 d增加較快，27 d后逐漸趨于平緩并有所下降。而各品種穎果干重在花后7～27 d增加較快，27 d后增加緩慢并有少許下降。同時(shí)，各品種穎果含水率則在花后7～27 d迅速降低，27～31 d降低趨于平緩，31 d后降低加快，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中總體表現(xiàn)為逐漸下降趨勢(shì)。與非糯大麥相比，糯大麥穎果鮮、干重在發(fā)育前、中期略低，在發(fā)育后期較高，而含水率總的趨勢(shì)為糯大麥高于非糯大麥。

2.4 大麥發(fā)育過(guò)程中穎果淀粉含量及可溶性糖含量的變化

在各品種大麥穎果的發(fā)育前期，可溶性糖含量處于較高水平，在花后5～13 d迅速降低，20 d后趨于平緩(圖4，A)。各品種穎果總淀粉含量變化大致呈“S”型曲線，其在花后5～13 d迅速增加，在花后13～20 d增長(zhǎng)速度有所減慢，在花后20 d后開(kāi)始趨于平穩(wěn)(圖4，B)。與非糯大麥相比，糯大麥穎果的可溶性糖含量在發(fā)育前期和中期明顯高于非糯大麥，而在發(fā)育后期兩者無(wú)顯著差異。在整個(gè)發(fā)育時(shí)期，糯大麥的總淀粉含量都明顯低于非糯大麥。

圖4 大麥穎果發(fā)育過(guò)程中可溶性糖和總淀粉含量的變化Fig.4 Changes of soluble sugar and total starch contents during the development of barley caryopsis

2.5 大麥胚乳淀粉體的發(fā)育

在胚乳淀粉體的出現(xiàn)時(shí)間上，非糯大麥約在花后5 d(圖5，a)，糯大麥則比較早，約在花后3 d。大麥腹部胚乳淀粉體大多出現(xiàn)在細(xì)胞核周圍，糯大麥胚乳淀粉體在花后5 d的數(shù)目多于非糯大麥、體積也大于非糯大麥(圖5，a～d)；花后9 d的糯大麥胚乳細(xì)胞中出現(xiàn)較多蛋白體，而非糯大麥中僅有少數(shù)幾個(gè)蛋白體，且糯大麥胚乳細(xì)胞淀粉體的數(shù)目明顯較多、體積較大；在花后13～27 d，大麥胚乳的淀粉體數(shù)目增多、體積增大(圖5，i～t)；在花后27 d，胚乳基本被淀粉體充實(shí)，蛋白體受淀粉體的擠壓而變形，并分布于淀粉體間的縫隙中，細(xì)胞核消失(圖5，q～t)。在兩類大麥的胚乳中，大淀粉體最先出現(xiàn)，在花后20 d之前快速增殖(圖5，m～p)，而小淀粉體在花后13 d開(kāi)始出現(xiàn)，之后迅速增殖生長(zhǎng)(圖5，e～h)。

同時(shí)，由圖5和圖6可以看出，大麥穎果背部胚乳淀粉體的發(fā)育及充實(shí)速度慢于腹部。在花后5 d，大麥穎果背部胚乳淀粉體出現(xiàn)的數(shù)目極少，且體積明顯小于腹部胚乳淀粉體(圖5，a～d；圖6，a～d)，淀粉體也是大多出現(xiàn)在細(xì)胞核周圍。在花后9～20 d，大麥穎果背部胚乳積累的淀粉體數(shù)目較腹部胚乳淀粉體少、體積小(圖5，e～t；圖6，e～t)。在穎果的發(fā)育后期，大麥淀粉胚乳細(xì)胞幾乎被大、小淀粉體充滿，且小淀粉體填滿大淀粉體之間的空隙。綜合圖5和圖6可看出，糯大麥與非糯大麥胚乳淀粉體在背部與腹部的發(fā)育規(guī)律相似。

a～d. 花后5 d的胚乳細(xì)胞；e～h.花后9 d的胚乳細(xì)胞；i～l.花后13 d的胚乳細(xì)胞；m～p.花后20 d的胚乳細(xì)胞；q～t.花后27 d的胚乳細(xì)胞；A.淀粉體；Nu.細(xì)胞核；PB.蛋白體; 標(biāo)尺=10 μm；圖6同圖5 糯大麥與非糯大麥腹部胚乳淀粉體的發(fā)育a-d. Endosperm cells of 5 days after anthesis; e-h. Endosperm cells of 9 days after anthesis; i-l. Endosperm cells of 13 days after anthesis; m-p. Endosperm cells of 20 days after anthesis; q-t. Endosperm cells of 27 days after anthesis; A. Amyloplast; Nu. Nucleus; PB. Protein body; The ruler is equal to 10 microns. The same as Fig.6Fig.5 Amyloplast development in abdominal endosperm of waxy and non-waxy barley

另外，大麥胚乳淀粉體發(fā)育過(guò)程中大、小淀粉體的面積及比例變化如圖7所示。隨著穎果發(fā)育天數(shù)的增加，大麥胚乳細(xì)胞中淀粉體所占的面積逐漸增加，且糯大麥品種大于非糯大麥品種，這說(shuō)明糯大麥胚乳淀粉體的充實(shí)度要優(yōu)于非糯大麥(圖7，A)。由圖7，B進(jìn)一步可看出，在花后9 d，糯大麥和非糯大麥小淀粉體的比例均在40%以下，且糯大麥的小淀粉體比例高于非糯大麥；隨著穎果發(fā)育天數(shù)的增加，小淀粉體的比例逐漸變大。在花后9～13 d，非糯大麥淀粉充實(shí)較快(圖7，A、B)；在花后20 d，糯大麥與非糯大麥小淀粉體的比例皆在80%左右，且糯大麥小淀粉體的比例高于非糯大麥(圖7，B)。

圖6 糯與非糯大麥背部胚乳淀粉體的發(fā)育Fig.6 Amyloplast development in dorsal endosperm of waxy and non-waxy barley

圖7 大麥穎果發(fā)育過(guò)程中胚乳細(xì)胞淀粉體的相對(duì)面積比及小淀粉體的比例Fig.7 The relative area of starch granules and proportion of small starch granules in endosperm cells during the development of barley caryopsis

圖8 大麥穎果在發(fā)育過(guò)程中表觀直鏈淀粉含量的變化Fig.8 Changes of apparent amylose content during the development of barley caryopsis

2.6 大麥穎果發(fā)育過(guò)程中胚乳淀粉體表觀直鏈淀粉含量的變化

從圖8可看出，花后5～27 d，糯大麥的表觀直鏈淀粉含量隨發(fā)育天數(shù)的增加而逐漸降低，而非糯大麥表現(xiàn)則與之相反；在整個(gè)穎果發(fā)育過(guò)程中，糯大麥表觀直鏈淀粉含量都明顯低于非糯大麥，且隨著生育期差異逐漸增大。

3 討 論

大麥穎果胚乳細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)，使穎果體積逐漸增長(zhǎng)。而果皮生長(zhǎng)前中期呈綠色，具有光合活性，隨著果皮葉綠素的降解[17]，類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致類胡蘿卜素的大量積累[18]等，穎果表皮褪掉綠色；在組織染色觀察過(guò)程中，大麥胚乳中淀粉的不斷積累使染色程度及面積出現(xiàn)變化；非糯大麥胚乳被I2/KI染成藍(lán)黑色，糯大麥的則被染成紅褐色，結(jié)合表觀直鏈淀粉測(cè)量結(jié)果，說(shuō)明非糯大麥胚乳淀粉以直鏈淀粉為主而糯大麥以支鏈淀粉為主[19]。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)有關(guān)：在植物細(xì)胞中，GBSS是決定直鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶[20]，是唯一與發(fā)育中的淀粉體結(jié)合并有活力的蛋白[21]，其兩種同工酶GBSSI、GBSSII分別主要在貯藏器官和營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)[22]。在谷物中編碼GBSSI的基因Waxy(wx)的突變體雖沒(méi)有明顯改變總淀粉含量，但在水稻、玉米、大麥等突變體的胚乳淀粉體中發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量降低或完全缺失[23]，而在高粱突變體的籽粒中則發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒中的支鏈淀粉含量增加[24]。即編碼GBSSI的基因的突變使直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例發(fā)生變化，這也是大麥形成糯性的根本原因[4]。此研究結(jié)果可作為最直觀、最簡(jiǎn)單的鑒定大麥糯性的依據(jù)。

在胚乳淀粉體的出現(xiàn)時(shí)間上，大麥胚乳淀粉體出現(xiàn)的時(shí)間與其他稻麥不同，水稻胚乳淀粉體大約在花后4 d出現(xiàn)，小麥胚乳在花后7 d開(kāi)始積累淀粉[25]，非糯大麥為5 d，糯大麥則更早，為3 d左右。依據(jù)王忠等的研究[26]將大麥淀粉粒分為A型(大)淀粉粒(直徑10～20 μm)和B型(小)淀粉粒(直徑3～5 μm)，侯維海等[27]的研究指出淀粉粒數(shù)量、粒徑和面積的變化與總淀粉含量有顯著關(guān)系，本研究結(jié)果表明，在大麥發(fā)育過(guò)程中，小淀粉體比例和胚乳淀粉體相對(duì)面積比與淀粉含量呈正相關(guān)性，與其研究結(jié)果一致。且侯維海等[27]測(cè)得西藏冬青稞干物質(zhì)和淀粉積累量呈“S”型曲線，本試驗(yàn)結(jié)果也與其一致，同時(shí)含水率的變化趨勢(shì)與王忠等[26]的研究結(jié)果也一致。羅偉等[28]指出含水率與谷類作物的導(dǎo)熱系數(shù)有關(guān)，可影響谷物的儲(chǔ)藏，同時(shí)含水率對(duì)谷物的干燥工藝也有很大的影響[29]，因而本研究中對(duì)含水率的探討結(jié)果可用于對(duì)不同糯性大麥的儲(chǔ)藏及干燥采取相應(yīng)措施。而對(duì)于大麥胚乳淀粉體中大、小淀粉體的出現(xiàn)時(shí)間，本研究則與侯維海等[27]的研究不一致，這可能與其研究的品種冬青稞與本試驗(yàn)品種不同、生長(zhǎng)環(huán)境等條件也不同等有關(guān)。對(duì)于小淀粉粒的增長(zhǎng)趨勢(shì)，本試驗(yàn)與伊祖濤等[30]在玉米穎果中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，即穎果發(fā)育前期，小型淀粉體數(shù)目百分比呈增加趨勢(shì)，發(fā)育后期，淀粉體粒徑分布趨于穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，糯大麥的淀粉體充實(shí)狀況優(yōu)于非糯大麥，因此，可根據(jù)此結(jié)果決定選擇不同糯性大麥品種。如根據(jù)不同要求來(lái)選用不同糯性大麥來(lái)制作天然淀粉、淀粉衍生物等。

王兵等[31]的研究指出小麥的淀粉體、蛋白體積累等與維管束有關(guān)，維管束又使谷物類的穎果區(qū)別出背、腹部，熊飛等[25]更明確指出養(yǎng)分運(yùn)輸時(shí)，由于背、腹部胚乳細(xì)胞離胚乳傳遞細(xì)胞及維管束的距離不同，使養(yǎng)分輸入的速率和多少有差異，從而導(dǎo)致胚乳背部與腹部淀粉體發(fā)育不同，此即本研究中大麥背部胚乳淀粉體的發(fā)育及充實(shí)速度有別于腹部的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，糯大麥的表觀直鏈淀粉及總淀粉含量較非糯大麥低，可溶性糖含量較高。一般來(lái)說(shuō)，直鏈淀粉可制作薄膜，用于包裝粉狀產(chǎn)品和速凍食品等，由于非糯大麥直鏈淀粉含量較高，故非糯大麥既可考慮用于食品生產(chǎn)中，又可作為糖尿病患者食物的理想選擇。由于糯大麥可溶性糖含量高，易于被動(dòng)物吸收，可用于動(dòng)物飼料產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。