葉 金，諸周潔，姚 捷，朱俊兆，王曉飛，丁沃娜*

(1 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2 寧波大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波 315212；3 浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 311300)

水稻作為重要的谷類糧食作物，養(yǎng)育著地球半數(shù)以上人口。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口數(shù)量增加，對水稻的質(zhì)量與數(shù)量的要求與需求越來越高。然而水稻總產(chǎn)量增幅由于眾多因素逐年下降，使得提高水稻產(chǎn)值仍是水稻研究者的優(yōu)先任務(wù)[1-2]。水稻根系研究始于1919年，且在近半世紀(jì)得到迅速的發(fā)展，眾多研究表明水稻根部特性與水稻地上部器官的生長發(fā)育及水稻單株產(chǎn)量息息相關(guān)[3-4]。

水稻根系主要分為主根、不定根、側(cè)根和根毛四個部分。水稻主根由種子中的胚根發(fā)育形成(僅1條)，主要在水稻幼苗期發(fā)揮作用，吸收土壤中水分及營養(yǎng)物質(zhì)。因發(fā)根位置的不同，在水稻莖部發(fā)生的根稱為不定根，數(shù)量較多[5]，水稻不定根結(jié)構(gòu)與主根基本相同[6]。在主根、不定根韌皮部的中柱鞘和內(nèi)皮層中長出側(cè)根[7]。根毛則是表皮細(xì)胞外伸形成的管狀凸起[8]。側(cè)根與根毛的存在增加了根的直徑與根系的表面積，擴(kuò)大了根系與根際土壤接觸面積，使得根系可以吸收的水分、流動或不流動的營養(yǎng)物質(zhì)范圍更廣[9]。

水稻根系結(jié)構(gòu)形態(tài)受多種因素影響。首先根系發(fā)育受基因調(diào)控，隨著水稻全基因組測序的完成，根系形態(tài)特征、生物學(xué)作用相關(guān)的基因被大量發(fā)現(xiàn)并克隆[10]。水稻根系形態(tài)也受環(huán)境因素的制約，根際含氧量可以影響水稻根長與其生物量[11-12]；在含水量低的土壤中，根系總量增多且根系較長[13]；過低溫與過高溫均抑制根系伸長，在一定溫度范圍內(nèi)，根系伸長量與溫度成正相關(guān)[14]。不同元素也影響根系生長，氮元素以NO3-形式存在時，有利于根系的伸長[15]；鋁元素對雜交水稻根系伸長具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[16]；硅元素對根系的長度與粗度具有促進(jìn)作用[17]。水稻根系發(fā)育的調(diào)控機制很復(fù)雜，目前人們對其認(rèn)知還很有限，更多水稻根系發(fā)育基因的克隆將有助于闡明作物根系發(fā)育調(diào)控的分子機理。

本研究選用從EMS(ethyl methane sulfonate)誘變的秈稻Kasalath突變體庫篩選而來的短根突變體Osksr6作為研究材料。苗期，Osksr6的根系與野生型有著明顯差異，主根顯著變短、側(cè)根發(fā)生與根毛伸長受不同程度的抑制。在此基礎(chǔ)上，對Osksr6進(jìn)行遺傳分析與基因定位，為該基因的克隆和分子機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 水稻材料準(zhǔn)備與培養(yǎng)

水稻短根突變體Osksr6，是EMS誘變的秈稻品種Kasalath突變體庫中篩選獲得的，其短根突變性狀經(jīng)幾代種植，確認(rèn)可穩(wěn)定遺傳。將可穩(wěn)定遺傳的突變體Osksr6與野生型秈稻Kasalath雜交產(chǎn)生的F2代群體用于遺傳分析；將Osksr6與粳稻品種日本晴Nipponbare雜交產(chǎn)生的F2代用于突變基因定位。

水稻種子用0.6%稀硝酸進(jìn)行破休眠處理，待露白后播種于水稻培養(yǎng)液進(jìn)行溶液培養(yǎng)[18]。人工氣候室培養(yǎng)條件：白天30 ℃ 12 h，夜晚22 ℃ 12 h，濕度為80%。

1.2 方 法

1.2.1突變體Osksr6的表型觀察和統(tǒng)計各取20株野生型Kasalath與突變體Osksr6生長7 d的幼苗，分別統(tǒng)計株高、主根長度、不定根長度、不定根數(shù)量。用照相機(Nikon D70s)觀察并拍攝具代表性的全株表型和根部性狀，且統(tǒng)計側(cè)根數(shù)量。用體式鏡(Leica MZ95，Germany)對水稻根莖結(jié)合部，主根中段和根尖進(jìn)行拍攝。

1.2.2突變體Osksr6的遺傳分析突變體Osksr6與野生型Kasalath雜交，產(chǎn)生的F1代與野生型有相似的長根性狀，取F1代自交產(chǎn)生的F2代種子400顆，播種于人工氣候室。取生長7 d的F2代幼苗，統(tǒng)計長根、短根數(shù)量，用卡方檢測分離比，確定顯隱性及是否為單基因突變。

1.2.3突變基因定位(1) DNA的提取。將Osksr6與粳稻品種日本晴Nipponbare雜交產(chǎn)生的F2種子萌發(fā)后用水稻培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，挑取短根表型的幼苗，采用TPS提取法提取單株幼苗的DNA[19]。選取其中30株苗的DNA，把濃度稀釋至100 ng/μL，每一管DNA吸取10 μL放入1.5 mL離心管中形成突變池，同時提取野生型Kasalath、日本晴Nipponbare、F1代幼苗的DNA。

(2) 分子標(biāo)記的選擇與設(shè)計。根據(jù)http:// www.gramene.org/網(wǎng)站中已公布的SSR簡單重復(fù)序列，選取98對實驗室已有的均勻覆蓋水稻12條染色體且各具特異性的SSR引物，用于突變基因的初定位。在已定位到的水稻染色體SSR分子標(biāo)記附近，根據(jù)已公布的秈稻品種9311、粳稻品種日本晴全基因組序列對比有差異兩側(cè)設(shè)計InDel標(biāo)記，進(jìn)行突變基因的精細(xì)定位。

(3) PCR擴(kuò)增和電泳。將提取的野生型、日本晴、F1代和F2代群體的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括：模板DNA、10×PCR buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTP、上下游引物、5 U/mLTaqDNA聚合酶、超純水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于6%非變性聚丙烯凝膠(PAGE)電壓190 V條件下電泳，3 h后銀染顯色分析并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體Osksr6的表型鑒定

通過比較溶液培養(yǎng)生長7 d的幼苗發(fā)現(xiàn)，Osksr6的地上部分和野生型Kasalath無明顯差異，但根系差異顯著。Osksr6主根長度為野生型的38.01%，不定根長度為野生型的 53.58%(表1)。在體式鏡下觀察根部表型，可知突變體根毛變短，側(cè)根發(fā)生和伸長都受抑制(圖1)。

比較成熟期野生型和突變體Osksr6的農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)：Osksr6的分蘗數(shù)明顯減少，株高與野生型相比無顯著差異。此外，Osksr6的總穗長和結(jié)實率均不如野生型(圖2、表2)。由此可得，Osksr6的基因突變不僅影響根系發(fā)育，而且影響水稻的分蘗及產(chǎn)量。

a．野生型(左)和突變體Osksr6(右)全株表型(標(biāo)尺=1 cm)；b．野生型(左)和短根突變體Osksr6(右)根部表型(標(biāo)尺=1 cm)；c～f.野生型(c, e)和Osksr6(d, f)的主根體視鏡照(標(biāo)尺=1 mm)圖1 野生型和突變體Osksr6生長7 d表型a. Seedlings of the wild type (left) and Osksr6 mutant (right), bar=1 cm; b. The root of wild type (left) and Osksr6 mutant (right), bar=1 cm; c- f: The primary root of wild type (c, e) and Osksr6 (d, f) under stereocope, bar=1 mmFig.1 Phenotypic characterization of 7-day old seedlings of wild type and Osksr6 mutant

a．野生型(左)和突變體Osksr6(右)全株表型(標(biāo)尺=10 cm)；b．野生型(左)和突變體Osksr6(右)稻穗表型(標(biāo)尺=2 cm)圖2 野生型和突變體Osksr6成熟期表型a. Phenotypic characterization of the wild type (left) and Osksr6 (right), bar=10 cm; b. Panicle characterization of the wild type (left) and Osksr6 (right), bar=2 cmFig.2 Mature phenotypes of wild type and Osksr6 mutant

性狀Trait 野生型 WTOsksr6較野生型增減Compared with WT/%株高Plant height/cm17.80±0.9517.77±0.59-0.17主根長Primary root length/cm13.47±0.635.12±0.66-61.98*不定根長aAdventitious root length/cm3.77±0.432.02±0.38-46.42不定根數(shù)Adventitous root number3.66±0.634.05±0.62+10.66側(cè)根數(shù)Lateral root number195.02±9.3146.18±5.67-76.32*

注：a最長3根不定根長度的平均值;數(shù)值后*表示0.05水平顯著性差異；下同

Note：aAverage of three longest adventitious roots on each plant; * means siginificonce difference at 0.05 level; the same as below

表2 野生型和突變體Osksr6的農(nóng)藝性狀參數(shù)

2.2 突變體Osksr6的遺傳分析

2.3 突變體Osksr6的基因定位

以混合30株短根突變體DNA形成的突變池、Kasalath、Nipponbare和F1的DNA為模板，用98對SSR引物逐一進(jìn)行驗證后發(fā)現(xiàn)，突變基因與第3染色體上SSR標(biāo)記RM5813存在連鎖關(guān)系(圖3)。擴(kuò)大定位群體，增加了142株短根單株，同時根據(jù)秈稻品種9311和粳稻日本晴基因組差異性，在RM5813物理位置附近設(shè)計了5對有多態(tài)性的InDel標(biāo)記(表4)，最終將突變基因定位在InDel標(biāo)記28420k和28880k之間(圖4)，物理距離約460 kb(圖5)，分析表明該區(qū)間沒有已報道的與根系發(fā)育相關(guān)的基因。

3 討 論

根系是水稻尤為重要的器官，影響地上部的性狀及產(chǎn)量。本研究的短根突變體Osksr6在幼苗期的主根、不定根、側(cè)根和根毛的生長發(fā)育均受到抑制，分蘗數(shù)、稻穗長和結(jié)實率等成熟期農(nóng)藝性狀受到顯著影響，說明OsKSR6基因呈一因多效，是一個與水稻生長發(fā)育和單產(chǎn)密切相關(guān)的重要功能基因。

表3 短根突變體Osksr6/ Kasalath F2的遺傳分析

1. Kasalath；2. Nipponbare；3. F1(Osksr6×Nipponbare)；4～24. F2短根單株圖3 同OsKSR6基因連鎖的SSR標(biāo)記RM5813的電泳圖1. Kasalath；2. Nipponbare；3. F1 (Osksr6 × Nipponbare)；4-21. Short root individuals in F2 populationFig.3 Electrophoresis of the SSR marker RM5813 linked with the OsKSR6 locus

表4 具有多態(tài)性的SSR及InDel標(biāo)記序列

圖5 OsKSR6在水稻第3染色體上的分子定位Fig.5 The gene mapping of OsKSR6 on rice chromosome 3

根據(jù)已報道的水稻根系相關(guān)基因?qū)?yīng)的突變體表型，與突變體Osksr6具有類似表型的基因有：OsSPR1[20]、OsKSR5[21]、OsCYT-INV1[22]、GLR3.1[23]、OsWOX11[24]和OsRAL1[25]等。OsSPR1基因位于第1染色體，突變體Osspr1第7天幼苗的主根與不定根變短，側(cè)根發(fā)生受抑制，成熟期植株較野生型變矮，分蘗數(shù)顯著減少，結(jié)實率也略有降低[20]。OsKSR5基因位于第1染色體，突變體Osksr5生長7 d時，主根長度為野生型的44.44%、不定根長度為野生型的53.44%、側(cè)根明顯變短；成熟期，突變體株高變矮(為野生型的59.90%)，分蘗數(shù)大幅減少，結(jié)實率為88.82%[21]。OsCYT-INV1基因位于第2染色體，幼苗期突變體表現(xiàn)出主根、不定根、側(cè)根均變短；花期延遲，花粉部分不育；成熟期分蘗數(shù)減少，結(jié)實率僅為11.5%[22]。GLR3.1基因位于第4染色體，發(fā)芽后的2周，與野生型相比突變體主根、側(cè)根、不定根均受到不同程度的抑制，突變體主根根尖直徑明顯變小；苗期之后與繁殖階段，野生型與突變體新生根系長度相當(dāng)；成熟期分蘗數(shù)與結(jié)實率受影響[23]。OsWOX11基因位于第7染色體，該基因突變后幼苗表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長缺陷，發(fā)芽后2周突變體幾乎沒有根冠產(chǎn)生；成熟階段植株高度明顯降低，分蘗數(shù)減少，結(jié)實率大幅下降[24]。OsRAL1基因突變，突變體表現(xiàn)出主根缺失，不定根、側(cè)根減少；成熟期分蘗數(shù)明顯減少[25]。

本研究通過圖位克隆技術(shù)，最終將OsKSR6基因定位在第3染色體上的InDel標(biāo)記28420k和28880k之間約460 kb范圍內(nèi)。目前在該區(qū)域還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)根系發(fā)育基因的報道，所以O(shè)sKSR6基因是一個調(diào)控水稻根系發(fā)育的新基因。對OsKSR6基因的進(jìn)一步研究，將有助于闡明水稻根系發(fā)育的分子機理，也為提高水稻單株產(chǎn)量提供基因資源。