王統(tǒng)苗，鄭圣晗，張 莘，陳博雯，劉本帥，張 揚(yáng)，王志秀，常國斌，陳國宏

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC），是大部分脊椎動物基因組中的一個基因家族，與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[1]。在雞中分為MHC-B復(fù)合體和MHC-Y復(fù)合體兩部分[2]。雞的MHC-B復(fù)合體包含了經(jīng)典I類和II類兩個位點(diǎn)。BTN2（B-butyrophilin 2）基因是MHC-B復(fù)合體中的典型基因座[3]。有研究表明MHC基因多態(tài)性與傳染性疾病的遺傳抗性高度相關(guān)[4]，MHC基因家族中BTN2基因在雞或火雞中很少表達(dá)，鑒定MHC-B在雞中的表達(dá)模式，能夠驗(yàn)證BTN2基因功能并提供MHC轉(zhuǎn)錄的組織特異性表達(dá)譜，這些表達(dá)譜可以作為未來免疫學(xué)研究的資源[5]。

R.Kama等[6]發(fā)現(xiàn)BTN2基因能夠在酵母中介導(dǎo)高爾基體蛋白分選，同時發(fā)現(xiàn)酵母BTN2基因與Hook1具有相似性，Hook1是與哺乳動物細(xì)胞中的細(xì)胞骨架相關(guān)的卷曲螺旋蛋白。正常水平的BTN2蛋白可以治愈大多數(shù)新形成的朊病毒變種。在人的MHC家族中BTN2是免疫球蛋白基因，能夠在所研究的所有組織中廣泛表達(dá)，但處于低轉(zhuǎn)錄水平[7]。

我國擁有豐富的地方雞資源，如狼山雞、仙居雞等，其優(yōu)質(zhì)性狀明顯、抗逆性強(qiáng)，因此研究并發(fā)現(xiàn)一些抗病基因具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)選取26個優(yōu)良雞種，并對其BTN2基因進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序，篩選出BTN2基因的SNP和INDEL位點(diǎn)，最后建立系統(tǒng)發(fā)育樹種探究不同地方雞種的同源性，以研究BTN2基因的遺傳多樣性，為雞的免疫和抗病育種研究提供候選基因。

1 材料和方法

1.1 雞品種來源及基因組DNA提取

本研究共采集26個雞品種：其中廣西黃雞（GXH）、綠殼蛋雞（LK）、隱性白羽雞（YB）、太湖雞（TH）、如皋雞（RG）、文昌雞（WC）、雪山草雞（XC）、SPF-來航雞（LH）、安卡雞（AK）、AA 雞（AA）、溧陽雞（LY）、羅斯雞（LS）、青腳麻雞（QJ）等 13個雞種來自揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室禽種資源基因庫，茶花雞（CH）、北京油雞（YJ）、烏骨雞（WG）、蕭山雞（XS）、河南斗雞（DJ）、黑狼山雞（HL）、藏雞（ZJ）、仙居雞（XJ）、固始雞（GS）、大骨雞（DG）、鹿苑雞（LuY）、白耳雞（BE）等12個雞種來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院家禽科學(xué)研究所，紅色原雞（HY）采集自云南省野生動物救護(hù)中心。每個雞種隨機(jī)取10個樣，采集翅靜脈血液2 mL，然后放入含肝素鈉的采血管中，加入裂解液，在4℃下保存，采用酚-氯仿抽提法提取DNA[8]。

1.2 BTN2基因序列對比分析與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

將所提取的DNA樣品送至深圳華大基因公司進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序，獲得序列，并以NCBI（National Center of Biotechnology Information）中原雞（Gallus gallus）序列為參照序列，并用MEGA6軟件對26個雞種進(jìn)行比對分析，統(tǒng)計(jì)BTN2基因的SNP位點(diǎn)和INDEL位點(diǎn)以及氨基酸的改變，最后運(yùn)用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（phylogenetic tree）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雞品種 BTN2基因的 SNP位點(diǎn)和Indel位點(diǎn)分析

雞BTN2基因的多態(tài)性主要在外顯子上表現(xiàn)，本研究以NCBI中原雞（Gallus gallus）的BTN2基因外顯子位點(diǎn)為參考，用MEGA6軟件對不同雞種堿基序列進(jìn)行比對分析。由表1可知，26個雞種中BTN2基因上共有152個SNP和INDEL。

2.2 不同雞品種BTN2基因的Exon上SNP位點(diǎn)和氨基酸變化

如表2所示，在26個雞種中BTN2基因外顯子中篩選出27個SNP位點(diǎn)，主要發(fā)生在Exon8上，其中來航雞和雪山草雞在3個位點(diǎn)都發(fā)生了突變，茶花雞在138 985位點(diǎn)發(fā)生的A/C、雪山草雞在138 970位點(diǎn)發(fā)生的C/A、SPF-來航雞在137 201位點(diǎn)發(fā)生的T/C、太湖雞在137 201位點(diǎn)發(fā)生的T/C引起的氨基酸變化為同義突變，其他相應(yīng)氨基酸均為錯義突變。白耳雞、廣西黃雞、烏骨雞、大骨雞、蕭山雞、黑狼山雞在外顯子上沒有SNP。結(jié)果表明，BTN2基因Exon8以及相應(yīng)的氨基酸的多態(tài)性表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性。在 Exon1、Exon3、Exon5、Exon7 沒有SNP，說明這幾個外顯子具有高度的保守性。

2.3 不同雞品種BTN2基因的Intron上SNP位點(diǎn)

為了進(jìn)一步探究BTN2基因中的堿基的多態(tài)性，本研究以Gallus gallus的BTN2基因內(nèi)含子為參考，采用MEGA6軟件對雞種堿基序列進(jìn)行分析比對，結(jié)果顯示16個雞種中BTN2基因內(nèi)含子有48個SNP位點(diǎn)；只有Intron5有一個INDEL位點(diǎn)；16個地方雞種的BTN2基因內(nèi)含子發(fā)生的SNP見表3。

表1 不同雞品種BTN2基因外顯子和內(nèi)含子上SNP和INDEL的分布情況Table1 Distribution of SNP and INDEL on exons and introns of BTN2 gene in different chicken breeds

表2 不同雞品種BTN2基因外顯子上SNP位點(diǎn)分布Table2 Distribution of SNP in BTN2 gene of different chicken breeds

2.4 不同雞品種BTN2基因的INDEL位點(diǎn)

由表4可知，BTN2基因的插入缺失多發(fā)生在外顯子上，且大多數(shù)雞品種INDEL序列基本一致。斗雞、綠殼蛋雞、如皋雞、雪山草雞、北京油雞在138 264～138 990位點(diǎn)上既發(fā)生插入又發(fā)生缺失，且插入的堿基序列都為T，缺失的序列為CAACA。廣西黃雞、烏骨雞在同一位點(diǎn)插入堿基T，黑狼山雞和白耳雞沒有發(fā)生INDEL。國外雞品種AA雞、安卡雞、羅斯雞、隱性白羽肉雞都插入堿基序列A。一些國內(nèi)雞品種，如茶花雞、太湖雞、藏雞也在同一位點(diǎn)插入堿基序列A。所以國內(nèi)外雞種的INDEL并無明顯差異。

表3 不同雞品種BTN2基因內(nèi)含子上SNP位點(diǎn)分布Table3 Distribution of SNPs in introns of BTN2 gene in different chicken breeds

2.5 不同雞品種BTN2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

不同雞種BTN2基因具有一定的多態(tài)性，為了進(jìn)一步探究不同雞種BTN2基因同源性，我們用MEGA6 軟件，使用 NJ（neighbour-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖1可知26個雞種分為3大類：文昌雞、SPF-來航雞、太湖雞、蕭山雞等聚為一類，他們都具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)；溧陽雞、北京油雞、如皋雞等聚為一類，他們都具有肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)；茶花雞、仙居雞、固始雞、大骨雞等聚為一類，他們具有生長速度快、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)。上述結(jié)果顯示，不同雞品種BTN2基因在進(jìn)化過程中有豐富的遺傳多樣性。

3 討論

BTN2基因?qū)儆贛HC家族成員之一。該基因與抗病力有關(guān)，在雞的抗病育種中具有較為重要的意義[9]。M.S.Monson等[5]發(fā)現(xiàn)BTN2基因主要在雞的肌肉組織中表達(dá)，在法氏囊和脾臟中表達(dá)有限。該研究同時表明MHC具有免疫應(yīng)答的重要功能，許多MHC-B基因也參與適應(yīng)性或先天性免疫，但其他一些則具有非免疫或未知功能。以前MHC-B基因研究一般只關(guān)注于幾個基因或組織，對于其在雞上的具體功能還不完全明確。因此通過對比不同雞種的基因序列，分析BTN2基因在不同雞種中發(fā)生的突變和插入缺失，對研究MHC-B在雞的肌肉組織中的具體作用至關(guān)重要。

本研究發(fā)現(xiàn)BTN2基因在不同雞品種之間存在著多處SNP和INDEL位點(diǎn)，發(fā)生在外顯子的SNP位點(diǎn)有27個。同時發(fā)現(xiàn)外顯子的SNP多發(fā)生在Exon8上，由此可以看出第8外顯子在BTN2基因中起決定性作用，決定著BTN2基因的遺傳多樣性。本研究同時發(fā)現(xiàn)有18個雞種在第8外顯子上都有A/C的突變。內(nèi)含子上的SNP位點(diǎn)有48個，近年來，人們認(rèn)為內(nèi)含子有許多新的功能，如維持染色體的特定結(jié)構(gòu)等。此外內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達(dá)起調(diào)控作用[10]。安卡雞、白耳雞、斗雞、廣西黃雞、SPF-來航雞、溧陽雞、青腳麻雞、如皋雞、太湖雞、文昌雞在內(nèi)含子上各具有3個SNP位點(diǎn)，這可能間接說明BTN2基因具有豐富的遺傳多樣性。白耳雞、蕭山雞、廣西黃雞和烏骨雞外顯子沒有SNP位點(diǎn)，同時在系統(tǒng)聚類圖上聚為一類，這可能是因?yàn)檫@四種雞的適應(yīng)能力強(qiáng)，抗病能力強(qiáng)。黑狼山雞和白耳雞在外顯子上既沒有SNP也沒有INDEL，這可能與這兩個雞種抗病性弱有關(guān)。張嬌等[11]的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。19個雞種中有64%在第8外顯子的138 978和138 969位點(diǎn)有A/C突變，其中AA雞、安卡雞、來航雞、溧陽雞、青腳麻雞、羅斯雞、文昌雞、隱性白羽雞、藏雞都在138 978位點(diǎn)有A/C突變，這一位點(diǎn)可作為BTN2基因有關(guān)抗病性的候選SNP位點(diǎn)。茶花雞、SPF-來航雞雖然發(fā)生了A/C的單堿基替換突變，但這個位點(diǎn)的堿基突變并未引起氨基酸變異，屬于同義突變。不同雞品種BTN2基因遺傳變異更加豐富，真實(shí)反映了不同雞品種先天免疫基因資源豐富、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)[12]。

表4 不同雞品種BTN2基因的INDEL分布Table4 INDEL distribution of BTN2 gene in different chicken breeds

圖1 不同雞種系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap=1 000）Figure1 Phylogenetic tree of different breeds （Bootstrap=1 000）

在本研究的系統(tǒng)聚類圖中，北京油雞和斗雞聚為一類，北京油雞的原產(chǎn)地主要集中在北京城近郊一帶，斗雞主要集中于河南，這兩個品種具有地理分布相近，生產(chǎn)速度緩慢等共同特點(diǎn)。聚類分析圖顯示，其他雞品種和茶花雞的同源性較低，茶花雞單獨(dú)分為一小類。這可能由于歷史原因造成的。茶花雞產(chǎn)于云南省，由于歷史上該地區(qū)相對比較封閉，與外來血緣交換較少，長期處于閉鎖繁衍并自然形成此優(yōu)良品種[13]。同時我們發(fā)現(xiàn)茶花雞在外顯子和內(nèi)含子上都有SNP，說明茶花雞具有豐富的遺傳多樣性，這與張廷欽等[14]利用血液蛋白及同工酶分析的結(jié)果一致。茶花雞的遺傳多樣性較高，主要有兩方面的可能原因：一是該雞種飼養(yǎng)粗放，育種目標(biāo)不清晰，較低的人工選擇強(qiáng)度，屬選育程度較低的地方品種[15]；二是該雞種與紅色原雞長期以來有一定的基因交流[16]。SPF-來航雞和太湖雞聚為一類，且他們發(fā)生的SNP為同一個堿基序列，雖然地理距離較遠(yuǎn)，但是他們可能曾經(jīng)發(fā)生過血緣交流。國外品種AA雞、隱性白羽肉雞和羅斯雞聚為一類，并且它們之間的同源性較高，這一結(jié)果和雞群體的育種歷史和地理分布基本一致[17]。

綜上，BTN2基因在國內(nèi)外雞品種中存在多種遺傳變異，尤其在中國地方雞品種中表現(xiàn)出極其豐富的遺傳多樣性，可為中國地方雞品種優(yōu)良的先天免疫性能的遺傳機(jī)制相關(guān)研究提供重要參考。然而，盡管本研究篩選出有關(guān)抗病特征的候選SNP位點(diǎn)，尚需進(jìn)一步研究以確定其能否對傳染性疾病產(chǎn)生抗性。