楊 園，聶林曼，付體華

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

普通小麥（Triticum aestivum L.）的改良依賴于豐富的遺傳多樣性，而小麥育種中所需的大多數(shù)有利遺傳變異都能夠由小麥族的野生近緣種作為基因源提供。遠(yuǎn)緣雜交是一種有效的植物物種間的基因轉(zhuǎn)移手段，在基因由小麥野生近緣種向普通小麥轉(zhuǎn)移的過程中尤為重要[1-2]。利用小麥與其野生近緣種的遠(yuǎn)緣雜交，育種者已合成了大量雙二倍體或部分雙二倍體。這些雙二倍體是重要基因轉(zhuǎn)移的中間載體，可以用于從小麥野生近緣物種向普通小麥中導(dǎo)入優(yōu)良性狀基因[3-4]。中間偃麥草（Thinopyrum intermedium，2n=6x=42，JJsSt）是一種多年生的異源六倍體草本植物，它具有許多優(yōu)良的遺傳多樣性，是小麥遺傳改良中一個(gè)重要的三級基因源[5-6]。過去的幾十年中，許多的屬間雜種和細(xì)胞遺傳系被創(chuàng)制并用于小麥育種中，這些品系包括不同小麥與偃麥草的部分雙二倍體、外源易位系、代換系以及附加系[4，7-12]?；蚪M原位雜交（GISH）技術(shù)具有簡單、準(zhǔn)確以及高效的特點(diǎn)，被廣泛地運(yùn)用于分析小麥與小麥野生近緣種的雜種后代的遺傳多樣性[13]。基于擬鵝觀草DNA（St染色體組）作為探針的GISH技術(shù)可將中間偃麥草染色體按雜交信號分布劃分為J，Js和St 3個(gè)染色體組[14]。中間偃麥草是一種自然雜交形成的多年生物種，據(jù)研究不同來源的中間偃麥草其染色體組成也不盡相同[15-17]?，F(xiàn)有的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體并沒有包含中間偃麥草所有染色體[3]。因此，為了將中間偃麥草的優(yōu)良基因整合到小麥中，我們?nèi)孕枰粩鄤?chuàng)制和選育新的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。到目前為止，已經(jīng)有一些雙二倍體被培育出來，并在分子細(xì)胞遺傳學(xué)層次上對其染色體組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，如TAF46、中字系列部分雙二倍體、Otrastsyuskaya（OT）、78829、TE-3、E990256、TE253和TAI8335等，這些雙二倍體所擁有的中間偃麥草染色體都存在一定的差異[3，6，18-21]，其中大多數(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于小麥改良中[5，22]?？偟膩碚f，這些被報(bào)道的部分雙二倍體具有旺盛的生長能力和高結(jié)實(shí)率，多數(shù)擁有56條染色體，通常由完整的小麥染色體組附加一個(gè)雜合的外源染色體組構(gòu)成[3]。也就是說包含56條染色體的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體其外源染色體數(shù)目都不少于14條。品系12-1179是我們實(shí)驗(yàn)室近年來選育的一個(gè)小麥-中間偃麥草部分雙二倍體，不僅對當(dāng)前我國流行的條銹病和白粉病具有高度的抗性，而且其包含的外源染色體數(shù)目少于14條，這表明它是一個(gè)攜帶不同染色體結(jié)構(gòu)的新的部分雙二倍體。在本研究中，我們希望通過GISH和FISH技術(shù)確認(rèn)其染色體結(jié)構(gòu)和外源染色體來源，并對其潛在的白粉病和條銹病抗性進(jìn)行評價(jià)，為其在遺傳育種研究的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括擬鵝觀草品系PI 232131（Pseudoroegneria spicata，St染色體組，2n=2x=24），小麥品種中國春、綿陽26、品系SY95-71和小麥-中間偃麥草雙二倍體品系12-1179，其中品系12-1179由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制、篩選和保存。該品系是以中國春小麥作為母本與中間偃麥草雜交得到F1代雜種，再與小麥栽培種綿陽26回交得到F2代雜種，從F2代雜種自交篩選結(jié)實(shí)性好的植株繁殖到F8代。擬鵝觀草種子來源于美國國家小粒作物收集中心。品系SY95-71來源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所的小麥，具有高度感染條銹病和白粉病能力[23]，作為感病對照。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

待種子在培養(yǎng)皿中生長到根尖約1.5～2 cm時(shí)，將根尖剪下放入一氧化二氮（N2O）中處理2 h，然后用90%的冰乙酸固定10 min，將其儲存于70%的乙醇中并于4℃冰箱中保存待用[24]。有絲分裂染色體制片根據(jù)Han F.等[25]的方法稍加改動制備。減數(shù)分裂制片是采取處于減數(shù)分裂中期Ⅰ的麥穗并將其固定在卡洛固定液Ⅰ中，用品紅對花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色。GISH采用擬鵝觀草DNA作為探針，而FISH采用Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1作為探針[26]。擬鵝觀草DNA采用地高辛（digoxigenin-11-dUTP）標(biāo)記，具體步驟按照地高辛說明書操作，中國春小麥DNA作為封阻。GISH的操作步驟根據(jù)Chen Q.等[14]和Han F.等[27]的描述進(jìn)行。寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1的5'端分別用6-carboxyfluorescein（6-FAM）和6-carboxytetramethylrhodamine（Tamra）進(jìn)行標(biāo)記[26]，由上海 Invitrogen Biotechnology公司合成。合成的寡核苷酸探針用1×TE緩沖液溶解和稀釋，稀釋倍數(shù)按照Tang Z.X.等[26]的描述進(jìn)行，F(xiàn)ISH程序按照Han F.等[25]的描述進(jìn)行。利用帶有CMOS相機(jī)以及Spotsoftware（V.4.6）的熒光顯微鏡（Nikon Eclips80i）進(jìn)行照相。

1.2.2 抗病性鑒定

品系12-1179以及其親本的白粉病與條銹病抗性測試分別在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安農(nóng)場進(jìn)行。小麥品系SY95-71屬于高感條銹病與白粉病的感染型（infection types，ITs），在本實(shí)驗(yàn)中被用作陽性對照評價(jià)小麥感病程度。通過在苗期接種3個(gè)白粉病菌株（E20，E21和race 15）來評價(jià)測試小麥品系的白粉病抗性，而在成株上接種當(dāng)前流行的混合的條銹病菌（包括條中 30，31，32及水源-46）評價(jià)測試小麥品系的條銹病抗性，條銹病菌由四川農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。當(dāng)SY95-71高度感病時(shí)，按照0到4級評價(jià)體系記載所鑒定品系的白粉病和條銹病抗性[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 品系12-1179的形態(tài)學(xué)以及農(nóng)藝性狀調(diào)查

成株12-1179表現(xiàn)為小麥-中間偃麥草中間形態(tài)，但更加偏向于其小麥親本（圖1a）。它具有直立生長的習(xí)性，成株高度在95～105 cm，矮于中國春小麥（125 cm）而高于綿陽26小麥（88 cm）。在田間，每個(gè)植株平均能產(chǎn)生4～6個(gè)有效分蘗；穗長為14～17 cm，每個(gè)麥穗具有17～20個(gè)小穗數(shù)，小穗在穗軸上分布較稀疏（圖 1b），平均結(jié)實(shí)率70%左右。種子的形態(tài)像中間偃麥草，種子細(xì)長但比較飽滿（圖1c），千粒重為28 g左右，界于小麥與中間偃麥草之間的水平。

圖1 小麥栽培種綿陽26與品系12-1179的形態(tài)特征Figure1 The morphology features of wheat cultivar Mianyang 26 and amphiploid line 12-1179

2.2 品系12-1179的細(xì)胞學(xué)鑒定

對28株12-1179材料進(jìn)行了根尖染色體計(jì)數(shù)。不同植株的染色體數(shù)目為54～57條，78.57%的植株染色體數(shù)目為56條（表1）。在部分非整倍體（2n=54或55）中可觀察到1～2個(gè)端著絲粒染色體（表1）。對12-1179植株（2n=56）減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的配對行為進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有54.05%的花粉母細(xì)胞（PMCs）能形成28個(gè)二價(jià)體（圖 2a），而在其他花粉母細(xì)胞中單價(jià)體為0～8個(gè)。少量的花粉母細(xì)胞中偶爾會觀察到一個(gè)三價(jià)體或四價(jià)體（圖2b）。通過對175個(gè)花粉母細(xì)胞（2n=56）減數(shù)分裂的統(tǒng)計(jì)，其減數(shù)分裂配對構(gòu)型為1.33Ⅰ+27.26Ⅱ+0.01Ⅲ+0.03Ⅳ（表2），表明品系12-1179在減數(shù)分裂傳代過程中基本保持穩(wěn)定。

使用擬鵝觀草DNA為探針，中國春小麥DNA為封阻的GISH技術(shù)對品系12-1179的外源染色體進(jìn)行了鑒定，28株12-1179材料的外源染色體組成結(jié)構(gòu)列于表1。結(jié)果表明所有12-1179植株的根尖細(xì)胞都僅含有12條中間偃麥草染色體（圖3a），未發(fā)現(xiàn)小麥-中間偃麥草易位染色體。根據(jù)GISH信號分布特點(diǎn)[14]，可將這12條外源染色體區(qū)分成中間偃麥草不同的染色體組。其中，6條染色體上都有強(qiáng)烈的雜交信號，屬于St染色體組，4條染色體著絲粒和端粒有強(qiáng)烈的雜交信號，屬于Js染色體組，而余下2條染色體一條臂在端粒處有雜交信號，而另一條整臂和著絲粒處都有雜交信號，屬于St-Js易位染色體（圖3a），易位染色體的易位點(diǎn)需進(jìn)一步研究確定。在12-1179中沒有發(fā)現(xiàn)J染色體。對減數(shù)分裂染色體的GISH分析表明減數(shù)分裂中期Ⅰ的花粉母細(xì)胞有6個(gè)二價(jià)體具有雜交信號（圖3b）。說明品系12-1179的12條外源染色體能夠在減數(shù)分裂期間正常配對，表明12-1179的外源染色體由3對St，2對Js以及1對St-Js易位染色體構(gòu)成。

表1 28個(gè)12-1179植株的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)Table1 Chromosome number and constitution in 28 plants of line 12-1179

表2 5個(gè)12-1179（2n=56）植株減數(shù)分裂中期I的配對統(tǒng)計(jì)Table2 Chromosome pairing at metaphase I in five 56-chromosome plants of line 12-1179

圖2 品系12-1179的減數(shù)分裂中期Ⅰ的結(jié)構(gòu)Figure2 Meiotic configurations at metaphaseⅠof line 12-1179

使用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和OligopTa535-1對品系12-1179進(jìn)行FISH分析以觀察小麥染色體數(shù)目及組成。結(jié)果表明12-1179具有完整的A和B染色體組，而在不同12-1179植株中有不同數(shù)目的D染色體。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，在12-1179植株（2n=54-57）中，5D 染色體數(shù)目為 2～5條（圖 3c～圖3e），而在2n=56的12-1179植株中，5D染色體數(shù)目為4條（圖 3c）。此外，在非整倍體（2n=54-55）植株中觀察到的端著絲粒染色體都為5DL（表1和圖3e）。因此12-1179中缺失的一對中間偃麥草染色體應(yīng)屬于第五同源群，其功能在很大程度上由增加的2條5D染色體補(bǔ)償。所以品系12-1179的外源染色體組的組成是6St+4Js+2Js-St+2*5D。根據(jù)已有報(bào)道，小麥-中間偃麥草部分雙二倍體的外源染色體組一般只由中間偃麥草的3個(gè)染色體組構(gòu)成[3]，因此，品系12-1179屬于一個(gè)新的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。

2.3 抗病性鑒定結(jié)果

利用當(dāng)前流行的白粉病菌株和混合的條銹病菌對品系12-1179及其親本進(jìn)行了抗病性鑒定。從田間表現(xiàn)來看，中間偃麥草與12-1179對所有接種的白粉病與條銹病都免疫，而小麥栽培種中國春和綿陽26都表現(xiàn)高感（表3）。由于品系12-1179的小麥親本都高感白粉病與條銹病，因此，12-1179的白粉病和條銹病抗性很可能來源于它的供體親本-中間偃麥草。

圖3 品系12-1179植株的GISH和FISH分析Figure3 GISH and FISH patterns of line 12-1179

3 討論與結(jié)論

對合成的小麥-外緣物種雙二倍體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的穩(wěn)定性評價(jià)在育種過程中具有理論指導(dǎo)和實(shí)際意義。一般而言合成的小麥-中間偃麥草雙二倍體都具有較穩(wěn)定的減數(shù)分裂行為，其二價(jià)體頻率高而多價(jià)體頻率低，同時(shí)具有良好的結(jié)實(shí)率[18]。G.Fedak等[3]報(bào)道不同的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體減數(shù)分裂中期I的二價(jià)體頻率變化在25.12～27.46之間，而單價(jià)體頻率在0.43～2.55之間。在我們所研究的2n=56植株中，由于存在4條5D染色體，理論上每一個(gè)減數(shù)分裂細(xì)胞中至少應(yīng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)四價(jià)體，然而根據(jù)175個(gè)花粉母細(xì)胞（2n=56）統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)54.05%的細(xì)胞能形成28個(gè)二價(jià)體，平均每個(gè)細(xì)胞有1.33個(gè)單價(jià)體，而每個(gè)細(xì)胞平均出現(xiàn)0.01個(gè)三價(jià)體和0.03個(gè)四價(jià)體，其多價(jià)體的數(shù)量遠(yuǎn)小于預(yù)期（表2）。表明品系12-1179減數(shù)分裂中期Ⅰ的染色體配對行為與已報(bào)道穩(wěn)定的部分雙二倍體相似[6，13，18]，也類似于穩(wěn)定的普通小麥缺體-四體的配對行為[30]。這表明品系12-1179在細(xì)胞學(xué)上十分穩(wěn)定，因此具有比較高的結(jié)實(shí)率，這些結(jié)果說明品系12-1179的染色體遺傳組成在很大程度上是平衡的[3]。

表3 12-1179和其親本的條銹病與白粉病的抗性鑒定Table3 Reactions to stripe rust and powdery mildew in partial amphiploid12-1179 and its parents

了解部分雙二倍體的外源染色體對于高效地將其優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移到小麥中進(jìn)行改良是非常重要的。因此，不同學(xué)者采用不同手段對選育的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體染色體組成進(jìn)行鑒定。根據(jù)報(bào)道，所有小麥-中間偃麥草雙二倍體（2n=56）的外源染色體都不少于14條，其中至少包括St，J和Js中的兩種，且小麥染色體至多42條[3，21]。在本研究中，通過GISH分析表明品系12-1179的外源染色體只有12條，其中包括3對St，2對Js和1對Js-St易位染色體。品系12-1179的外源染色體少于已有報(bào)道雙二倍體（2n=56）的外源染色體數(shù)目（圖 3a）。FISH分析表明，12-1179包含4條5D染色體（圖 3c），但能進(jìn)行穩(wěn)定地減數(shù)分裂且結(jié)實(shí)率達(dá)70%。由此我們推測中間偃麥草染色體組中的一對外源染色體由兩條5D替換，而且外源染色體缺失的功能由5D染色體補(bǔ)償，因此這個(gè)復(fù)合的外源染色體組不僅包含中間偃麥草染色體，還應(yīng)該包含兩條5D染色體。12-1179具有不同于已報(bào)道的部分雙二倍體，如中字系列[19]，TAF46[31]，78829[32]，OT[18]，TAI8335[6]和 TE253[13]等的染色體組成，以上部分雙二倍體都擁有一個(gè)由14條不同中間偃麥草染色體組成的復(fù)合染色體組，因此12-1179是一個(gè)新的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。

在農(nóng)藝性狀方面，成株12-1179與小麥親本更相似，卻沒有旺盛的生長習(xí)性和分蘗能力，小穗數(shù)也偏少，可能原因是第五同源群的中間偃麥草染色體被小麥5D替換所致。我們知道調(diào)節(jié)小麥春化作用以及區(qū)分小麥為春性、冬性和半冬性基因Vrn位于小麥第5同源群染色體長臂上，特別是5AL和5DL[33-35]。Vrn基因負(fù)責(zé)調(diào)控小麥營養(yǎng)生長和生殖生長之間的轉(zhuǎn)換[36]。中國春小麥5D缺體是唯一導(dǎo)致小麥產(chǎn)生冬小麥習(xí)性且使抽穗期延遲的缺體小麥[37]，所以小麥染色體5D替換了中間偃麥草的第五同源群染色體，導(dǎo)致品系12-1179的冬性特征減弱而更類似于春小麥親本且分蘗能力較弱。

中間偃麥草作為一種重要的多年生小麥族物種，對多種真菌病害有良好的抗性以及對不利環(huán)境有很好的耐受性[16，19，38]。因此，中間偃麥草在小麥遺傳改良中能作為抗性基因的供體被廣泛地使用。迄今為止，抗小麥條紋花葉病毒（WSMV）[39]、抗大麥黃矮病毒（BYDV）[32，40-41]、抗鐮刀菌枯萎病[42]、抗條銹病[9]、抗葉銹病[43]、抗莖銹病[22]和抗白粉病基因[11，44-45]已經(jīng)被鑒定并從中間偃麥草轉(zhuǎn)移到小麥中應(yīng)用。

白粉病和條銹病是兩種世界最嚴(yán)重的小麥疾病，每年在全世界引起小麥大規(guī)模減產(chǎn)。已有報(bào)道中，中間偃麥草Js或St染色體上的白粉病和條銹病抗性基因已經(jīng)轉(zhuǎn)移運(yùn)用到小麥中。B.Friebe等[43]報(bào)道了一個(gè)被定位在7Ai-2染色體上的條銹病抗性基因，Tang S.等[16]鑒定7Ai-2染色體屬于Js染色體組。而來源于小麥-中間偃麥草后代品系X479的條銹病抗性基因則被定位在1St染色體上[12]。He R.L.等[44]研究發(fā)現(xiàn)白粉病抗性基因Pm43是從一條未知的Js染色體上轉(zhuǎn)移到小麥的2DL上。通過C帶和GISH鑒定，同樣來源于普通小麥與中間偃麥草抗白粉病品系08-723，發(fā)現(xiàn)其攜帶的白粉病抗性基因來源于一條6AS與St的易位染色體[11]。在本研究中，品系12-1179包含6條St，4條Js和2條St-Js，對條銹病和白粉病具有免疫的特性，其白粉病和條銹病抗性基因應(yīng)來源于St或Js。但其抗性基因是否與以往報(bào)道相同，還需要進(jìn)一步研究?，F(xiàn)在我們正在通過抗性篩選來選育具有抗白粉病與條銹病的外源附加系，代換系以及易位系小麥。