薛亮 王愛霞 歸翔剛

摘 要 在293細(xì)胞培養(yǎng)體系中感染腺病毒后，繼續(xù)保持培養(yǎng)液中一定濃度的葡萄糖提供碳源，以維持宿主細(xì)胞更好的生命狀態(tài)，促進(jìn)腺病毒的復(fù)制、裝配、釋放，達(dá)到提高單批次病毒生產(chǎn)的產(chǎn)量。在病毒活性比穩(wěn)定的前提下，改進(jìn)后病毒顆粒數(shù)（產(chǎn)量）有41.1%的提升。

關(guān)鍵詞 293細(xì)胞 腺病毒 殘?zhí)强刂?/p>

中圖分類號(hào)：Q813.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）15-0072-03

Improvement of the process for adenovirus production

XUE liang*， WANG Aixiang， GUI Xianggang

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT After infection of adenovirus in the 293 cell culture， a certain concentration of glucose was continuously supplied in the culture medium to maintain the host cell in a better growth condition so as to promote the replication， assembly and release of the adenovirus and to improve the yield of single-batch virus production. The number of virus particles （production） could be improved by 41.1% on the premise of a stable virus activity ratio.

KEY WORDS 293 cell； adenovirus； residual sugar control

隨著生物制藥的普及和發(fā)展，病毒活載體疫苗的研制成為基因工程疫苗研制的熱點(diǎn)，其中，腺病毒由于具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為疫苗載體應(yīng)用中不可缺少部分[1]。腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界廣泛分布，對(duì)人致病性小，不誘導(dǎo)癌變，較為安全，不整合入細(xì)胞基因組，遺傳毒性低，宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染效率高，易于制備、純化[2]。并且，腺病毒因其宿主細(xì)胞廣，繁殖滴度高，裝載容量大，成為近年來病毒載體研究熱點(diǎn)[3]。直接將腺病毒載體導(dǎo)入人體內(nèi)表達(dá)目的基因，治療惡性腫瘤、心血管疾病或一些遺傳疾病已取得可喜進(jìn)展[1]；利用腺病毒載體在包裝細(xì)胞293中表達(dá)分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的一條途徑。因此，完善293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及腺病毒擴(kuò)增技術(shù)具有越來越重要的市場(chǎng)意義[4]。腺病毒的生產(chǎn)以細(xì)胞感染病毒為分水嶺可分為細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)2個(gè)階段， 細(xì)胞感染病毒后，病毒的釋放時(shí)機(jī)及收獲等的生產(chǎn)工藝參數(shù)一直是業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點(diǎn)，而通過生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)降本增效也已成為業(yè)內(nèi)的共識(shí)。本研究主要探討在細(xì)胞感染病毒后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)保持一定濃度的葡萄糖，從而達(dá)到提高單批次病毒生產(chǎn)產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

14 L CelliGen Plus生物反應(yīng)器、Disk載體（NBS公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；DMEM高、低糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；葡萄糖試劑盒（上海名典生物工程有限公司）；分光光度計(jì)（上海尤尼克儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原生產(chǎn)工藝

采用CelliGen Plus的生物反應(yīng)器系統(tǒng)及Disk載體（兜籃式載體貼壁培養(yǎng)方式）培養(yǎng)293細(xì)胞，上罐細(xì)胞總量大1×109個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量（混合氣體總量）0.4 L/min、工作體積10 L、含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量4.5 g/L）培養(yǎng)， 24 h后開始用含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液灌注培養(yǎng)6～9 d（根據(jù)每批次的細(xì)胞狀態(tài)而定），當(dāng)體系內(nèi)細(xì)胞量處于飽和狀態(tài)（根據(jù)糖耗值判斷），接入病毒感染活性濃度3.16×1011 TCID50/ml的腺病毒懸液50 ml。病毒感染8 h后恢復(fù)對(duì)培養(yǎng)體系的灌注，灌注用的培養(yǎng)液是含5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，逐步降低灌注量，約48 h后采用含2% 胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量含量1 g/L）灌注培養(yǎng)，72 h后檢測(cè)體系內(nèi)病毒顆粒數(shù)，當(dāng)反應(yīng)體系內(nèi)腺病毒濃度達(dá)到1×1010 vp/ml時(shí)，開始連續(xù)收獲系統(tǒng)內(nèi)的灌注打出液（病毒液），灌注體積（收獲量）是4 L/d，收獲約4 d左右，當(dāng)反應(yīng)體系內(nèi)的用氧量回復(fù)到初始狀態(tài)（罐內(nèi)無細(xì)胞生長(zhǎng)跡象）時(shí)，終止培養(yǎng)。

感染病毒后每24 h檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖含量，發(fā)現(xiàn)在0～48 h內(nèi)，由于用高糖培養(yǎng)液灌注，系統(tǒng)內(nèi)殘?zhí)橇吭?.7 g/L左右，而48 h開始，用低糖培養(yǎng)液液灌注后，系統(tǒng)內(nèi)的殘?zhí)橇吭?.05 g/L，甚至更低，處于無糖狀態(tài)。

1.2.2 改進(jìn)后生產(chǎn)工藝

細(xì)胞培養(yǎng)階段按1.2.1中的工藝操作，病毒感染后，每24 h取樣檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖含量，48～120 h期間，仍然使用DMEM高糖培養(yǎng)液灌注，該段培養(yǎng)過程中，控制系統(tǒng)內(nèi)殘?zhí)窃?.3～1.0 g/L左右。在培養(yǎng)的后期（120 h開始）可采用含2%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量1 g/L）灌注培養(yǎng)，直至培養(yǎng)終止。

1.3 檢測(cè)方法

1）以培養(yǎng)過程中用氧量的比例（系統(tǒng)自帶自動(dòng)測(cè)定）來對(duì)比改進(jìn)前后培養(yǎng)體系內(nèi)相同時(shí)段內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

2）用顆粒數(shù)檢測(cè)和病毒活性檢測(cè)（TCID50）來觀察改進(jìn)后單批次病毒的產(chǎn)量及活性變化[5]。

2 結(jié)果

生物反應(yīng)器在滅菌后將通氣量設(shè)定在0.4 L/min。當(dāng)將系統(tǒng)溶氧值設(shè)定在50%時(shí)，系統(tǒng)會(huì)利用外接的空氣、氧氣、氮?dú)庾詣?dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)內(nèi)的溶氧狀態(tài)，使之達(dá)到設(shè)定的溶氧值（50%）。由于內(nèi)部沒有細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到平衡后，此時(shí)三種氣體的用量占比（總流量是0.4 L/min）是固定值，正常情況下此時(shí)氧氣用量是0，由空氣和氮?dú)庀嗷セ旌峡刂企w系內(nèi)的溶氧值。當(dāng)接種細(xì)胞后，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)耗氧，氮?dú)獾挠昧恐鸩较陆?，遂開始用氧。由于系統(tǒng)內(nèi)除293細(xì)胞外，沒有其他生物體代謝耗氧，所以可通過氧氣用量占比判斷系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。用氧占比高表明系統(tǒng)內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量大；反之，系統(tǒng)內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量少。

用改進(jìn)后的方法連續(xù)生產(chǎn)7批次，收集每批次感染病毒后系統(tǒng)每天的用氧情況，取均值，與之前生產(chǎn)的11個(gè)批次對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)比較（圖1）。

結(jié)果表明，改進(jìn)后的工藝從第4天開始，用氧量的下降趨勢(shì)明顯小于改進(jìn)前，并且用氧量回歸到系統(tǒng)生產(chǎn)前調(diào)試階段時(shí)初始值的時(shí)間平均比改進(jìn)前延后了24 h，表明在之后相同的培養(yǎng)時(shí)段，改進(jìn)后系統(tǒng)內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)量多于改進(jìn)前，并有延遲凋亡的跡象。

用改進(jìn)后的方法連續(xù)生產(chǎn)7批次，與改進(jìn)前生產(chǎn)的11個(gè)批次對(duì)比見表1。

改進(jìn)后工藝生產(chǎn)的病毒顆粒數(shù)（產(chǎn)量）與改進(jìn)前工藝相比有41.1%的提升，病毒活性比沒有太大變化，表明新工藝可提高單批次的病毒產(chǎn)量，對(duì)病毒的活性沒有影響。

3 分析與討論

3.1 原工藝設(shè)計(jì)思路

原工藝制定受產(chǎn)品研發(fā)階段的培養(yǎng)模式影響較大。

產(chǎn)品研發(fā)階段，使用培養(yǎng)皿小試生產(chǎn)腺病毒。293細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期，用DMEM高糖（葡萄糖含量4.5 g/L）培養(yǎng)，細(xì)胞利用葡萄糖作為碳源，代謝產(chǎn)物為乳酸。而在293細(xì)胞感染病毒后，如繼續(xù)使用DMEM高糖培養(yǎng)液，會(huì)造成細(xì)胞代謝旺盛，產(chǎn)生的酸性環(huán)境，從而導(dǎo)致病毒的衣殼發(fā)生裂解，對(duì)病毒的擴(kuò)增及最終的活性起到負(fù)面作用[6]。

用以下兩個(gè)小實(shí)驗(yàn)來了解293細(xì)胞糖代謝后的產(chǎn)酸情況及對(duì)病毒生產(chǎn)的影響。

1）在培養(yǎng)皿體系用DMEM高糖測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)后產(chǎn)酸結(jié)果：293細(xì)胞以1∶2傳代，72 h培養(yǎng)（未感染病毒），代謝后的培養(yǎng)液檢測(cè)，pH在6.85左右。

2） 對(duì)培養(yǎng)皿體系中的293細(xì)胞接入腺病毒時(shí)分別使用DMEM高糖（葡萄糖含量4.5 g/L）和DMEM低糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量1 g/L），培養(yǎng)48 h以上，同時(shí)收獲，分別檢測(cè)pH、病毒顆粒數(shù)和活性（表2）。

表2所示，病毒培養(yǎng)階段使用高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)酸較多，而用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的病毒顆粒數(shù)和活性都較低，所以在當(dāng)初工藝設(shè)計(jì)時(shí)，感染病毒后改用DMEM低糖培養(yǎng)，通過減少碳源量降低乳酸代謝產(chǎn)物，避免過酸環(huán)境影響到病毒的產(chǎn)量，該設(shè)計(jì)不僅用于培養(yǎng)皿制備腺病毒，后來也應(yīng)用于生物反應(yīng)器的大規(guī)模病毒生產(chǎn)。

3.2 原工藝設(shè)計(jì)的合理性和局限性

1） 合理性 在培養(yǎng)皿培養(yǎng)過程中，除了少量的氣體交換外，既沒有其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充和交換，也沒有酸堿調(diào)節(jié)體系，減少碳源似乎是降低體系內(nèi)酸度的唯一方法。所以在一次性收獲的培養(yǎng)皿制備中具有一定的合理性（可避免細(xì)胞過度產(chǎn)酸影響病毒產(chǎn)量）。

2） 局限性 但利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)階段和病毒擴(kuò)增階段都采用灌注培養(yǎng)方式（新鮮培養(yǎng)液pH在8.0～8.5間），并配有補(bǔ)堿（8%碳酸氫鈉溶液）系統(tǒng)，兩者都可以中和體系中（系統(tǒng)pH控制在7.0～7.4）的乳酸，所以這種設(shè)計(jì)意義不大，相反低糖環(huán)境易造成細(xì)胞低代謝水平會(huì)引起細(xì)胞過早凋亡，在連續(xù)收獲的反應(yīng)器體系中會(huì)影響病毒的產(chǎn)量。

3.3 討論

從上述數(shù)據(jù)對(duì)來看，在大規(guī)模灌注培養(yǎng)腺病毒的工藝中，感染病毒后0～120 h之間系統(tǒng)內(nèi)的含葡萄糖量（碳源）決定了這批次可有效用于腺病毒擴(kuò)增的活細(xì)胞數(shù)量和生命狀態(tài)，而這些與最終腺病毒的產(chǎn)量有著直接關(guān)系。細(xì)胞感染病毒后直徑從15 mm增至17 mm。在感染8～48 h期間，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗以及乳酸的生成量均增加了30%～100%，氧氣的消耗和三磷酸腺苷的生成也有類似的趨勢(shì)。因此，在培養(yǎng)病毒階段更要注意營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的適度補(bǔ)給，一方面及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖，因?yàn)樵诓《緮U(kuò)增過程中，一旦葡萄糖耗竭會(huì)導(dǎo)致病毒擴(kuò)增的停止[7]。病毒從接入細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)后，要經(jīng)過入侵細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制（病毒蛋白外殼和病毒核酸）、細(xì)胞內(nèi)裝配和破裂宿主細(xì)胞等幾個(gè)階段，這個(gè)過程約48～72 h。如果在48～120 h內(nèi)灌注1 g/L的低糖培養(yǎng)液，低碳源的環(huán)境加速了細(xì)胞的凋亡，降低了細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制、裝配的成功率；而在48～120 h內(nèi)依然灌注4.5 g/L的高糖培養(yǎng)液，改善系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞代謝條件，維持細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，可為腺病毒的復(fù)制、裝配提供更多的時(shí)間和穩(wěn)定的宿主生長(zhǎng)條件，從而提高病毒產(chǎn)量。

另外，CelliGen Plus生物反應(yīng)器系統(tǒng)的特點(diǎn)是啟動(dòng)后，難以從系統(tǒng)中取樣計(jì)算細(xì)胞量（打開罐體將會(huì)破壞無菌生長(zhǎng)環(huán)境），因而培養(yǎng)過程中采用檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖含量值來判斷細(xì)胞生長(zhǎng)情況。盡管病毒感染時(shí)，病毒細(xì)胞數(shù)比值即感染復(fù)數(shù)（MOI）按1∶20估算，實(shí)際情況下仍有大量正常細(xì)胞未被感染[8-9]，所以感染病毒后繼續(xù)保持系統(tǒng)內(nèi)的含糖量有利于維持過量的細(xì)胞的狀態(tài)，利用病毒的二次感染也是提高批次病毒產(chǎn)量的途徑之一。

為了在病毒感染后對(duì)系統(tǒng)內(nèi)的殘?zhí)强刂圃?.3～1 g/L的范圍內(nèi)，除了改用高糖培養(yǎng)液外，還在某些時(shí)段增加了灌注量，這也就相應(yīng)增加了一些收獲液的體積，從而增加了后期純化的工作量，可考慮使用更高糖濃度的培養(yǎng)液或單獨(dú)補(bǔ)糖來解決。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁子國(guó)， 張秀香， 高勝言， 等. 腺病毒載體的研究進(jìn)展與展望[J]. 吉林畜牧獸醫(yī)， 2008， 29（1）： 13-14.

[2] 秦娜. ndrg2兩亞型重組腺病毒的構(gòu)建及其抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的研究[D]. 西安： 第四軍醫(yī)大學(xué)， 2009.

[3] 張立堂. 用于結(jié)腸癌個(gè)性化治療的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建： 個(gè)性化治療之一[D]. 杭州： 浙江理工大學(xué)， 2008.

[4] 李慧文. 論在生物制藥中細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用[J].黑龍江科技信息， 2014（36）： 121.

[5] 薛惠斌， 施軍霞， 朱文川， 等. 腺病毒CNHK200-hEndostatin質(zhì)量控制方法的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 28（9）： 1011-1014.

[6] 王海偉， 宋姍姍， 曾健雄， 等. Asia1型口蹄疫病毒耐酸株的篩選及其耐酸表型的分子決定因素[C]// 北京： 第十屆全國(guó)病毒學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集， 2016： 224.

[7] 祁麗， 顧銘， 叢威. 重組腺病毒生產(chǎn)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 過程工程學(xué)報(bào)， 2004， 4（5）： 475-480.

[8] 張瓊宇， 馬珊珊， 唐小標(biāo)， 等. 病毒感染復(fù)數(shù)影響腺病毒感染T淋巴細(xì)胞效率的初步研究[J]. 生命科學(xué)研究， 2017， 21（4）： 312-317.

[9] 陳科達(dá)， 吳潔， 王一虎， 等. 用生物反應(yīng)器擴(kuò)增重組腺病毒的優(yōu)化工藝方法： CN103160478A[P]. 2013-06-19.