邱小倩 許原原 王若楠 李寶珍 楊金水 袁紅莉

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院 北京100193

苜蓿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的礦物質(zhì)、多種維生素、微量元素及胡蘿卜素，適口性好，是各種牲畜最喜食的牧草，被譽(yù)為“牧草之王”。自2012年國(guó)家實(shí)施“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”計(jì)劃以來，我國(guó)苜蓿行業(yè)發(fā)展迅速，但優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)量仍嚴(yán)重供不應(yīng)求，預(yù)計(jì)到2020年全國(guó)優(yōu)質(zhì)苜?？傂枨罅繉⑦_(dá)到610萬噸。此外，近年來化肥過量使用造成的土壤環(huán)境問題日益突出，豆科植物與根瘤菌共生能將自然界中植物難以直接利用的氮轉(zhuǎn)化為可直接利用的氨[1]，減少氮肥使用的同時(shí)，還起到改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力的作用，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。提高豆科植物與根瘤菌的結(jié)瘤固氮效率，增加豆科植物產(chǎn)量，不僅具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且是解決化肥過量使用的有效途徑之一。

黃腐酸可以促進(jìn)豆科植物結(jié)瘤固氮。早在1983年，Tan等[2]就發(fā)現(xiàn)黃腐酸可以使大豆、花生等豆科植物的根瘤干重增加。Rezazadeh等[3]也發(fā)現(xiàn)，噴施黃腐酸后豇豆的結(jié)瘤數(shù)增加了16.15%，根瘤的含氮量增加12.95%。欒白等[4]發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的黃腐酸能提高大豆種子的萌發(fā)率，顯著提高其抗氧化酶的活性，促進(jìn)種子的萌發(fā)。Gao等[5]通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)微生物降解褐煤生成的黃腐酸可以加快大豆根瘤菌（Bradyrhizobium liaoningense CCBAU05525）的代謝和營(yíng)養(yǎng)攝入，提高大豆根瘤菌的細(xì)胞密度，并且誘導(dǎo)根瘤菌nod基因的表達(dá)，最終促進(jìn)大豆的結(jié)瘤固氮。

本研究在大田試驗(yàn)條件下，對(duì)豆科牧草——紫花苜蓿進(jìn)行噴施黃腐酸及接種根瘤菌處理，研究黃腐酸對(duì)苜蓿結(jié)瘤固氮及產(chǎn)量的影響，以期為黃腐酸在牧草種植上的大面積應(yīng)用，以及減少氮肥施用條件下提高牧草產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃腐酸

采用本研究室專利技術(shù)“微生物降解生產(chǎn)黃腐酸方法（ZL02158189.4）”[6]中描述的方法發(fā)酵生產(chǎn)黃腐酸。發(fā)酵后產(chǎn)物的提取方法如下：10 g褐煤發(fā)酵產(chǎn)物加入100 mL去離子水，攪拌12 h后，10000 rpm，15 min離心3次，上清液經(jīng)真空抽濾進(jìn)一步去除固體不溶物后，40 ℃烘干備用。

根據(jù)Gao等[5]研究結(jié)果確定黃腐酸的使用濃度為0.5 g/L。

1.1.2 試驗(yàn)根瘤菌菌株

Sinorhizobium meliloti CCBAU01290，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心提供，分離自內(nèi)蒙古地區(qū)，經(jīng)田間試驗(yàn)證明能與紫花苜蓿（“敖漢”）高效結(jié)瘤固氮[7]。

1.1.3 苜蓿品種

“中苜一號(hào)”紫花苜蓿（Medicago sativa L.），購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所。

1.1.4 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2013—2015年在北京市順義區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所基地（40°5′N，116°16′E）進(jìn)行。經(jīng)檢測(cè)，土壤有機(jī)質(zhì)含量為14.2 g/kg，全氮含量為1.02 g/kg，堿解氮含量為121 mg/kg，有效磷含量為68.8 mg/kg，速效鉀含量為173 mg/kg，土壤pH為7.88。在苜蓿播種前平整土地，同時(shí)每畝地施加1250 kg有機(jī)肥作為底肥。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

苜蓿于2013年9月2日播種，行距30 cm，播種量1千克/畝，田間常規(guī)管理。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：對(duì)照（噴施等量清水）；噴施黃腐酸；接種根瘤菌。每個(gè)處理5次重復(fù)，隨機(jī)分布，每個(gè)小區(qū)面積為20 m2。

1.2.2 方法

噴施黃腐酸處理：苜蓿播種后，將0.5 g/L的黃腐酸溶液按照每畝地50 L的量均勻噴灑到播種的溝穴內(nèi)，然后再覆土。

接種根瘤菌處理：根瘤菌在YMA平板上活化2次后，接種至YMA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，使菌體密度達(dá)到1010～1011cfu/mL。

接種方式：苜蓿播種到溝穴后，將適當(dāng)稀釋后的菌懸液按照活菌數(shù)約107個(gè)/粒種子均勻噴灑到種子上（每畝地約需要150 mL菌劑），然后再覆土。

2015年第1次刈割（2015年5月22日）25天后，除對(duì)照外，各個(gè)處理在苜蓿根部再一次均勻噴施黃腐酸。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 樣品采集

在2013年11月6日，即苜蓿種植2個(gè)月后，在各個(gè)處理每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)大小一致的10株苜蓿，統(tǒng)計(jì)結(jié)瘤數(shù)并稱量根瘤鮮重，檢測(cè)苜蓿的結(jié)瘤情況。分別在2014年及2015年的5、7、8月苜蓿的開花期測(cè)定苜蓿產(chǎn)量（地上干重，共6次）；并測(cè)定2015年第1次刈割時(shí)根瘤的固氮酶活性。

1.3.2 測(cè)定方法

根瘤數(shù)及根瘤鮮重：每個(gè)小區(qū)取10株長(zhǎng)勢(shì)大小一致的苜蓿，將帶有根瘤的根剪下，洗凈后放入密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，用鑷子小心將根瘤摘下，統(tǒng)計(jì)數(shù)量，用分析天平稱重。

苜蓿產(chǎn)量：在每個(gè)小區(qū)內(nèi)選取約2～3 m2的區(qū)域收割苜蓿直接測(cè)量鮮重，并從每份測(cè)產(chǎn)的樣品中隨機(jī)抽取約1 kg鮮苜蓿風(fēng)干至恒重，計(jì)算干重，再換算為每公頃產(chǎn)量。

固氮酶活性：采用乙炔還原法測(cè)定[8]。[固氮酶活性=樣品乙烯峰面積×瓶體積×標(biāo)準(zhǔn)乙烯的量/（標(biāo)樣乙烯峰面積×上樣體積×瘤重×反應(yīng)時(shí)間）]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)苜蓿結(jié)瘤的影響

在苜蓿種植2個(gè)月后，檢測(cè)了對(duì)照、噴施黃腐酸及接種根瘤菌處理的苜蓿根瘤數(shù)及根瘤鮮重。結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照相比，接種根瘤菌后苜蓿根瘤數(shù)增加2.29倍，且差異顯著；噴施黃腐酸后使苜蓿根瘤數(shù)增加0.33倍，這說明黃腐酸在一定程度上促進(jìn)了土著根瘤菌與苜蓿的結(jié)瘤。噴施黃腐酸處理的苜蓿根瘤鮮重最高，為對(duì)照的1.84倍?？梢姡S腐酸對(duì)苜蓿結(jié)瘤的作用主要體現(xiàn)在根瘤大小上，即單個(gè)根瘤的重量上；而接種根瘤菌的處理，苜蓿根瘤鮮重與對(duì)照比雖然有所增加，但是差異不顯著。

綜上，噴施黃腐酸或接種根瘤菌對(duì)苜蓿的結(jié)瘤均有積極作用。

圖1 不同處理對(duì)苜蓿根瘤數(shù)（A）及根瘤鮮重（B）的影響Fig.1 Effects of different treatments on the number (A) and fresh weight (B) of alfalfa nodules

2.2 不同處理對(duì)苜蓿固氮酶活性的影響

苜蓿是多年生豆科牧草，根瘤菌的接種效果是否能持續(xù)多年一直是人們關(guān)心的問題。固氮酶活性能夠直接反應(yīng)根瘤的固氮能力，因此我們選擇在第2年（2015年）第1次刈割時(shí)進(jìn)行固氮酶活性的測(cè)定，以檢測(cè)所施加的黃腐酸及接種的根瘤菌是否仍能促進(jìn)苜蓿的共生固氮效率。

圖2為不同處理對(duì)苜蓿根瘤固氮酶活性的影響。結(jié)果顯示，噴施黃腐酸和接種根瘤菌的2個(gè)處理的固氮酶活性顯著高于對(duì)照：噴施黃腐酸處理顯著提高了苜蓿根瘤的固氮酶活性，說明黃腐酸不僅促進(jìn)土著根瘤菌與苜蓿結(jié)瘤，還可提高其單位質(zhì)量根瘤的固氮效率，顯著提高土著根瘤菌與苜蓿的結(jié)瘤固氮效率；接種根瘤菌的處理，苜蓿植株固氮酶活性顯著高于對(duì)照，說明接種的根瘤菌在經(jīng)過冬季低溫后，在翌年春天仍然能夠發(fā)揮一定的作用，且其固氮效率高于土著根瘤菌。

圖2 不同處理對(duì)苜蓿根瘤固氮酶活性的影響Fig.2 Effects of different treatments on nitrogenase activity of alfalfa nodules

2.3 不同處理對(duì)苜蓿產(chǎn)量的影響

苜蓿在開花期測(cè)定其產(chǎn)量，于2014年及2015年的5、7、8月共6次連續(xù)2年對(duì)苜蓿產(chǎn)量進(jìn)行了測(cè)定。2014年苜蓿測(cè)產(chǎn)結(jié)果如表1所示，與對(duì)照的年產(chǎn)量16324.79 kg/hm2相比，噴施黃腐酸處理苜蓿年產(chǎn)量為21152.5 kg/hm2，增產(chǎn)達(dá)29.57%，而接種根瘤菌處理苜蓿年產(chǎn)量為18001.65 kg/hm2，增產(chǎn)10.27%。

2015年苜蓿測(cè)產(chǎn)結(jié)果如表2所示。對(duì)照處理苜蓿年產(chǎn)量為15934.22 kg/hm2；噴施黃腐酸處理苜蓿年產(chǎn)量為19176.39 kg/hm2，比對(duì)照增產(chǎn)20.35%；接種根瘤菌處理苜蓿年產(chǎn)量為20609.28 kg/hm2，比對(duì)照增產(chǎn)29.34%，增產(chǎn)效果明顯。由表2可以看出，在2015年6月重新補(bǔ)施黃腐酸后，與對(duì)照相比，第2次刈割苜蓿的產(chǎn)量雖沒有顯著增加，但第3次刈割的產(chǎn)量較對(duì)照而言明顯提高。也就是說，在苜蓿過冬后的春天，苜蓿返青時(shí)補(bǔ)施黃腐酸，能顯著增加第2年苜蓿的產(chǎn)量。對(duì)2年的產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可以發(fā)現(xiàn)，噴施黃腐酸及根瘤菌處理相比對(duì)照（年產(chǎn)量32259.01 kg/hm2）苜蓿分別增產(chǎn)25.02%和19.69%。以上結(jié)果說明，噴施黃腐酸及接種根瘤菌對(duì)苜蓿生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)效果。

表1 2014年不同處理對(duì)苜蓿產(chǎn)量的影響Tab.1 Effects of different treatments on alfalfa yields in 2014

表2 2015年不同處理對(duì)苜蓿產(chǎn)量的影響Tab.2 Effects of different treatments on alfalfa yields in 2015

3 結(jié)論

噴施黃腐酸能夠促進(jìn)土著根瘤菌與苜蓿結(jié)瘤，增加根瘤數(shù)及根瘤鮮重，同時(shí)可提高單位質(zhì)量根瘤固氮酶活性，進(jìn)一步增加苜蓿的固氮總量，2年使苜蓿增產(chǎn)高達(dá)25.02%，效果甚至好于接種根瘤菌，為苜蓿在大面積種植上施用黃腐酸奠定了基礎(chǔ)。今后，繼續(xù)研究同時(shí)噴施黃腐酸并接種根瘤菌對(duì)苜蓿生長(zhǎng)的影響，對(duì)深入揭示黃腐酸促進(jìn)苜蓿結(jié)瘤固氮機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義。