陽(yáng)美霞，張虹亮，李藍(lán)祁，張羽芳，楊利國(guó)，王水蓮*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070)

哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育是由體內(nèi)各種生長(zhǎng)因子、垂體促性腺激素和類固醇激素共同調(diào)節(jié)的一個(gè)連續(xù)而復(fù)雜的生理過(guò)程[1-2]。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞分泌抑制素(inhibin, INH)、雌二醇(estradiol, E2)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF)等細(xì)胞因子，影響卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)育[3-4]。INH是由α和β亞基組成的異二聚體糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)超家族成員之一，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖、類固醇激素產(chǎn)生及卵母細(xì)胞成熟，參與卵泡發(fā)育[5-7]。INHβ能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞凋亡，甚至在豬的卵泡發(fā)育過(guò)程中上調(diào)卵泡閉鎖率[8]。合成的抑制素α(1～32)片段在牛顆粒細(xì)胞中能抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。

CpG寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)是含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤基序的短單鏈合成DNA分子，是一種能誘導(dǎo)或增強(qiáng)各類免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)劑[10-12]。研究表明，CpG-ODN具有免疫刺激活性，能誘導(dǎo)Ⅰ型免疫應(yīng)答，隨后激活機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫[13]。激活人體細(xì)胞的最佳CpG-ODN基序是5′-GTCGTT-3′，而對(duì)小鼠細(xì)胞具有活化作用的最佳CpG-ODN基序是5′-GACGTT-3′[14]。Yeh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，合成的CpG-ODN能有效激活人和小鼠TLR9介導(dǎo)的NF-κB和細(xì)胞因子，并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)激。含CpG-ODN的疫苗可介導(dǎo)細(xì)胞增殖，干擾啟動(dòng)子活性和免疫基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫刺激，顯著增加動(dòng)物體內(nèi)IgM和抗病毒分子Mx2的含量[16]。

盡管CpG-ODN作為佐劑已表現(xiàn)出提高動(dòng)物免疫力的能力，但CpG-ODN是否影響哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育尚無(wú)報(bào)道。已有研究表明，INH可抑制豬顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響類固醇激素生成，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育過(guò)程[8]。在Geng等[9]研究基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計(jì)并合成了對(duì)小鼠細(xì)胞具有免疫刺激活性的CpG-ODN基序，構(gòu)建含免疫基序CpG-ODN片段和抑制素α(1～32)片段的重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN，并轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中死亡受體通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化，以探討CpG-ODN能否拮抗抑制素對(duì)顆粒細(xì)胞發(fā)育的抑制作用，為降低顆粒細(xì)胞凋亡和促進(jìn)卵泡發(fā)育提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 21～23日齡雌性ICR小鼠購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 菌種及生化試劑 抑制素質(zhì)粒pEGISI(含綠色熒光蛋白(GFP)、乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及抑制素(INH)基因)由曹少先等[17]構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Hind Ⅲ、LiopfectamineTM2000、Opti-MEM培養(yǎng)基(Thermo scientific，美國(guó))；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、柱式RNA提取試劑盒(天恩澤，北京)；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)；DME/F-12培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 CpG-ODN片段的設(shè)計(jì)與合成 選擇對(duì)小鼠細(xì)胞具有激活作用的CpG基序：5′-GACGTT-3′，根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)具有免疫作用的CpG-ODN片段，由華大基因技術(shù)有限公司合成(劃線部分為限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基)。

正鏈：5′-CTCGAGCGGCACGTTGACGTTCACG-TTGACGTTCACGTTGACGTTCACGTTGACGTT CCCAAGCTTGGG-3′。

1.2.2 重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN的構(gòu)建及鑒定 將帶有酶切位點(diǎn)的CpG-ODN片段和pEGISI質(zhì)粒分別用XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶于4 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，將冰浴好的混合物放入42 ℃水浴90 s，再冰浴2～3 min，混合物置于700 μL無(wú)抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)45 min，然后取100 μL均勻地涂布于含有Kana抗生素的LB固體平板上，平板于37 ℃ 恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。質(zhì)粒進(jìn)行單菌落篩選，上游引物：5′-CGCAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTGGGAACGTCAACGT-3′。用TaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共35個(gè)循環(huán)。

1.2.3 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取21～23日齡雌性ICR小鼠5只，用乙醚麻醉小鼠后，迅速將其頸椎脫臼處死。小鼠腹部用75%的酒精棉球進(jìn)行擦拭消毒。于無(wú)菌環(huán)境中迅速取出雙側(cè)卵巢，體式顯微鏡下去除多余的輸卵管、脂肪及其它組織。用預(yù)熱的PBS沖洗卵巢3遍，4號(hào)針頭刺破卵泡，釋放出顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞。加入1 mL完全培養(yǎng)基(DME/F-12+15%FBS+1%青鏈霉素)進(jìn)行吹打，用40 μm的過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離卵母細(xì)胞，得到的細(xì)胞懸液于1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，獲得細(xì)胞沉淀。顆粒細(xì)胞以1×106·mL-1密度鋪板于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 顆粒細(xì)胞以2×106·孔-1密度

鋪板于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前24 h，更換為無(wú)雙抗培養(yǎng)基(DME/F-12+15%FBS)。試驗(yàn)分為3組：pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為空載體組，抑制素重組質(zhì)粒pEGISI轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組，含CpG-ODN基序的重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN轉(zhuǎn)染組為試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。用脂質(zhì)體LipfectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別用47和44 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋DNA(3 μg)和LipofectamineTM2000(6 μL)，室溫靜置5 min后，將兩者混合至體積為100 μL·孔-1，室溫靜置20 min，呈點(diǎn)滴狀添加到6孔板內(nèi)，5 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)柱式RNA提取試劑盒中說(shuō)明書(shū)操作，每孔加入500 μL Trizol溶液提取細(xì)胞中的總RNA。通過(guò)OD260 nm/OD280nm的比值和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析所提取RNA的質(zhì)量及完整性。用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄總RNA得到模板cDNA，將cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)凋亡基因mRNA的表達(dá) 用熒光定量PCR儀(ABI Step One)檢測(cè)死亡因子受體(Fas)/死亡因子Fas配體(FasL)和死亡因子受體(DR4/5)/死亡因子DR4/5配體(TRAIL)通路中相關(guān)基因的表達(dá)。qRT-PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，50×ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3.4 μL，總體積10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。所有操作過(guò)程均在冰上完成。以β-actin作為內(nèi)參基因，并用2-△△CT法分析試驗(yàn)結(jié)果。qRT-PCR引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS 17.0的單因素方差分析法(One-way ANOVA)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，**P<0.01表示差異極顯著，*P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組抑制素質(zhì)粒 pEGISI-CpG-ODN的鑒定

2.1.1 擴(kuò)增CpG-ODN 片段 重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN經(jīng)單菌落篩選，用普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示,在100 bp左右出現(xiàn)目的片段，與擴(kuò)增CpG-ODN片段的引物大小相符合(圖1)。以pEGISI-CpG-ODN 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示,在100 bp左右出現(xiàn)明顯條帶(圖1)。

2.1.2 測(cè)序結(jié)果 將pEGISI-CpG-ODN菌落條帶正確的單菌落進(jìn)行擴(kuò)菌，并用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒小提，質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，含免疫片段的CpG-ODN核苷酸序列正確插入到pEGISI質(zhì)粒中，證明重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN構(gòu)建成功(圖2)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pEGISI-CpG-ODN單菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2. CpG-ODN PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M．DL2000 DNA marker; 1. PCR amplification product of pEGISI-CpG-ODN single colony; 2. PCR amplification product of CpG-ODN圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of PCR amplification

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的鑒定

3種質(zhì)粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48 h，熒光顯微鏡觀察各孔細(xì)胞中綠色熒光蛋白(EGFP)的熒光強(qiáng)度和轉(zhuǎn)染數(shù)目(圖3)，各組轉(zhuǎn)染效率為60%左右。

圖2 pEGISI-CpG-ODN質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig.2 The sequencing result of pEGISI-CpG-ODN plasmid

A. pEGFP；B. pEGISI；C. pEGISI-CpG-ODN圖3 熒光顯微鏡檢測(cè)質(zhì)粒在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況(10×10)Fig.3 The expression of plasmids in granulosa cells detected by fluorescence microscopy (10×10)

2.3 小鼠顆粒細(xì)胞RNA提取

3種質(zhì)粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞中總RNA的提取，微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD260 nm/OD280 nm比值均為1.8～2.0。1.2%瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性。28 S、18 S和5 S條帶清晰可見(jiàn)，表明所提總RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)研究(圖4)。

1.pEGFP；2. pEGISI；3. pEGISI-CpG-ODN圖4 小鼠顆粒細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Results of the agarose gel electrophoresis of total RNA in mice GCs

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細(xì)胞后CpG mRNA表達(dá)的變化

3種質(zhì)粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，采用qRT-PCR法檢測(cè)CpG在各組細(xì)胞中的表達(dá)量。結(jié)果表明，與pEGFP組和pEGISI組相比，含CpG-ODN基序的pEGISI-CpG-ODN組中CpGmRNA的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)(圖5)。

組間比較：*. P<0.05; **. P<0.01。下同Comparison among groups：*. P<0.05; **. P<0.01.The same as below圖5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后CpG mRNA的表達(dá)Fig.5 The expression of CpG mRNA in the mouse granulosa cells after plasmid transfection

2.5 qRT-PCR檢測(cè)Fas/FasL死亡受體通路中基因的表達(dá)

3種質(zhì)粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，用qRT-PCR法檢測(cè)Fas/FasL通路中關(guān)鍵基因在各組細(xì)胞中的含量。結(jié)果表明，與pEGFP組相比，pEGISI組中顆粒細(xì)胞促凋亡基因Fas的mRNA水平顯著上升(P<0.05)，促凋亡基因FasL、Caspase8和Caspase3的mRNA水平極顯著上升(P<0.01)；與pEGISI組相比，pEGISI-CpG-ODN組中顆粒細(xì)胞促凋亡基因Fas、FasL、Caspase8和Caspase3 mRNA的水平極顯著下降(P<0.01)(圖6A)。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)DR4/5/TRAIL死亡受體通路中基因的表達(dá)

3種質(zhì)粒(pEGFP、pEGISI和pEGISI-CpG-ODN)轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，用qRT-PCR法檢測(cè)DR4/5/TRAIL通路中關(guān)鍵基因在各組細(xì)胞中的表達(dá)量。研究結(jié)果表明，與pEGFP組相比，pEGISI組中顆粒細(xì)胞促凋亡基因TRAIL的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與pEGISI組相比，pEGISI-CpG-ODN組中顆粒細(xì)胞促凋亡基因DR4/5、TRAIL的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(圖6B)。

3 討 論

在雌性動(dòng)物中，INHα亞基基因主要存在于卵泡顆粒細(xì)胞中，其功能是負(fù)反饋抑制垂體促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)的合成與分泌，拮抗激活素的活化作用，影響卵泡發(fā)育[18-19]。用含INHα(1～32)片段的重組質(zhì)粒(pVAX-asd-IS)免疫小鼠，結(jié)果表明，重組抑制素蛋白具有免疫功能，并可在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制40代[20]。Geng等[9]用過(guò)表達(dá)INHα(1～32)亞基的融合表達(dá)質(zhì)粒(pEGISI)轉(zhuǎn)染牛顆粒細(xì)胞，在48和96 h處均能顯著抑制顆粒細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡率極顯著上升，但48和96 h無(wú)顯著差異。另有研究表明，用抗INHα亞基抗體處理豬顆粒細(xì)胞，24 h后細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，但在處理后48 h能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]，表明用外源因子處理顆粒細(xì)胞48 h可能是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的最適時(shí)間點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，用含INHα(1～32)片段的抑制素質(zhì)粒(pEGISI)轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中促凋亡基因FasL、Caspase8和Caspase3的表達(dá)

圖6 小鼠顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染后凋亡基因mRNA的表達(dá)Fig.6 The mRNA expression levels of apoptotic genes in mouse granulosa cells after transfection plasmid

量極顯著高于pEGFP組(P<0.01)，與上述報(bào)道一致。據(jù)報(bào)道，除Fas/FasL死亡受體通路外，腫瘤壞死因子中DR4/5死亡受體與其配體TRAIL結(jié)合能也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]，但其配體TRAIL不直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而是通過(guò)激活Caspase8的活性啟動(dòng)下游凋亡基因的功能，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[23]。

目前尚沒(méi)有關(guān)于INHα亞基是否通過(guò)影響DR4/5/TRAIL死亡受體通路中基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報(bào)道。本研究表明，pEGISI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48 h后，DR4/5和TRAIL基因的表達(dá)量較pEGFP組出現(xiàn)降低趨勢(shì)，可能受顆粒細(xì)胞發(fā)育階段不同或種屬原因影響，但其具體機(jī)制還需深入研究。綜上，在顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)INHα亞基能增強(qiáng)內(nèi)源性抑制素對(duì)顆粒細(xì)胞的抑制作用，引起細(xì)胞中死亡受體通路相關(guān)基因的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CpG-ODN是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫佐劑，可激活先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[24]，已在許多動(dòng)物模型中表現(xiàn)出抗病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染和增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答等功效[25-28]。Yu等[29]用脂多糖(LPS)與CpG-ODN結(jié)合，發(fā)現(xiàn)結(jié)合CpG-ODN的LPS能顯著降低小鼠B細(xì)胞促凋亡基因CASP4、CASP9和Dapk1的表達(dá)情況，且上調(diào)抗凋亡基因IL-10的表達(dá)。另有研究報(bào)道，CpG-ODN與藥物結(jié)合后經(jīng)腹腔注射治療腦損傷C57BL/6模型小鼠，能增加抗凋亡基因Bcl-2的水平，并減弱缺血腦組織中Bax和Caspase3的活性[30]。為進(jìn)一步探討體外試驗(yàn)中CpG-ODN與抑制素質(zhì)粒DNA結(jié)合是否會(huì)對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，本研究以pEGISI質(zhì)粒為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了含CpG-ODN的重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN，且qRT-PCR結(jié)果表明，pEGISI-CpG-ODN組中CpGmRNA的含量顯著高于pEGFP組和pEGISI組(P<0.01)。同時(shí)，本研究通過(guò)檢測(cè)Fas/FasL和DR4/5/TRAIL兩條死亡受體通路中關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)水平，對(duì)重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN的作用效果進(jìn)行初步評(píng)估。結(jié)果顯示，pEGISI-CpG-ODN組與pEGISI組相比能極顯著下調(diào)顆粒細(xì)胞中Fas/FasL和DR4/5/TRAIL死亡受體通路中關(guān)鍵基因(Fas、FasL、DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3)mRNA的表達(dá)水平(P<0.01)。因此，本研究證實(shí)了CpG-ODN與pEGISI質(zhì)粒融合能降低抑制素對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中促凋亡基因mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了含CpG-ODN免疫基序的重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN，并轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中，表明CpG-ODN能一定程度上減弱外/內(nèi)源性抑制素對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，下調(diào)細(xì)胞中促凋亡基因mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育。