李小璟，龔雙燕，馬海強(qiáng)，劉 丹，高 健，彭 雪，朱 玲，2，徐志文，2*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130； 3.四川百諾吉科技有限公司，綿陽621000)

1963年，自噬研究者Christian de Duve 首次公開提出“自噬”這一概念，而后自噬這一名詞逐漸開始出現(xiàn)在人們的視線中。自噬(autophagy)是細(xì)胞普遍的代謝途徑之一，也是細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制之一，發(fā)生自噬的細(xì)胞通過溶酶體降解機(jī)制對自身細(xì)胞器和外源異物進(jìn)行包裹、吞噬、降解，將細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、病原微生物等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸等小分子物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)利用和抵抗異物入侵[1]。依據(jù)被降解物運(yùn)送至溶酶體方式的不同，自噬通常分為三種類型:分子伴侶自噬、微自噬、巨自噬[2]。巨自噬發(fā)生時(shí)可通過透射電鏡在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)雙層膜包裹的非細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，其中常包裹衰老變形的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、外來異物及入侵的病原微生物等，這種雙層膜結(jié)構(gòu)被稱作“自噬泡”，自噬泡是目前較為認(rèn)可的自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。自噬相關(guān)基因統(tǒng)稱為ATG，以酵母自噬基因的研究為例，目前已有30個(gè)左右的酵母基因被證實(shí)參與自噬過程。不同的ATG在自噬發(fā)生時(shí)擔(dān)負(fù)不同的功能，如ATG6主要在自噬泡形成的早期發(fā)揮作用[4]，ATG1主要是對自噬的發(fā)生起激活作用[5]，ATG5與ATG12相互結(jié)合，形成聚合體[6]，促進(jìn)LC3蛋白脂質(zhì)化，進(jìn)而促進(jìn)自噬。小分子GTP酶家族成員Rab11a被證明在自噬體成熟中具有重要作用，且Rab11a被沉默后將導(dǎo)致胞內(nèi)PRRSV NSP2和ORF7的表達(dá)受到損害[7]。已有研究表明PRRSV能激活細(xì)胞自噬，自噬被激活后PRRSV繼續(xù)阻止自噬體和溶酶體融合以維持自噬發(fā)生，并通過該方式利用自噬來增強(qiáng)自身復(fù)制[8-9]。就自噬基因而言，Beclin1作為比較重要的自噬基因，其在自噬發(fā)生中具有啟動意義[10]，同時(shí)也與病毒增殖關(guān)系密切[11]。自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ也是自噬監(jiān)測的重要指標(biāo)，LC3Ⅱ蛋白水平的高低與自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)量密切相關(guān)。LC3蛋白能裂解成為LC3Ⅱ和LC3Ⅰ，這兩者均能在一定程度上反映細(xì)胞的自噬水平，但通常認(rèn)為LC3Ⅱ/內(nèi)參蛋白更能真實(shí)反映自噬情況[12-13]。

近年來，越來越多的研究證明細(xì)胞自噬與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切[14]，與病毒復(fù)制也有一定關(guān)系[15]，自噬也越來越受到研究者的重視。值得一提的是，在細(xì)胞自噬的研究上，相關(guān)蛋白的研究比較多，但對自噬相關(guān)基因的研究卻較少。Beclin1作為近年自噬研究中的明星分子，其mRNA的轉(zhuǎn)錄變化具有重要研究意義。ATG5與ATG12在自噬過程中形成復(fù)合物，對細(xì)胞自噬過程起正向調(diào)控作用，探究ATG5與ATG12基因mRNA的轉(zhuǎn)錄規(guī)律對了解自噬過程有積極意義。本研究對感染PRRSV SC株前后Marc145細(xì)胞Beclin1、ATG5和ATG12的mRNA基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行測定，探究PRRSV SC株對Marc145細(xì)胞自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響及規(guī)律、為細(xì)胞自噬與病毒增殖相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與病毒

Marc145細(xì)胞系、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)SC株均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及儀器

pMD19-T Simple Vector、RNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司，SYBR Green Premix ExTaqⅡ、DL2000 DNA Marker等均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自行制備。實(shí)時(shí)熒光定量儀器CFX-96 touch購自BIO-RAD公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的Beclin1、ATG5和ATG12基因序列(登錄號NC_027908.1等)利用DNAStar軟件分析比較，選擇保守區(qū)域序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Primer5分別設(shè)計(jì)一對特異性引物，引物序列及預(yù)期目的片段長度如表1。

1.4 熒光定量PCR方法的建立

1.4.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 反應(yīng)體系采用25 μL，分別對引物、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、TM值和反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，以熒光值、Ct值、熔解曲線為判定依據(jù)，同時(shí)設(shè)立空白對照，選擇最優(yōu)的反應(yīng)條件。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，參照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 重復(fù)性、穩(wěn)定性及敏感性試驗(yàn) 于不同時(shí)間對梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)，共計(jì)5次，觀察所呈現(xiàn)曲線的組間穩(wěn)定性和重復(fù)性。抽選同一稀釋梯度下的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，設(shè)立3個(gè)重復(fù)，觀察所呈現(xiàn)曲線的組內(nèi)穩(wěn)定性和重復(fù)性。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍連續(xù)稀釋后作為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過熒光信號和電泳條帶判斷其敏感性。

1.5 樣品準(zhǔn)備及熒光圖片的采集

1.5.1 孔板的制備 5%二氧化碳濃度及37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Marc145細(xì)胞，使用含10%血清濃度的DMEM培養(yǎng)基，吸取細(xì)胞懸液于6孔板中，每孔2.5 mL。按相同方法共鋪6個(gè)6孔板，3個(gè)用于試驗(yàn)組等待接毒，3個(gè)用作對照(為Marc145細(xì)胞)。試驗(yàn)組按0.5 MOI接毒，接毒1 h后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入2.5 mL維持液。重復(fù)兩次，共計(jì)三次重復(fù)。

1.5.2 樣品的收集 Marc145細(xì)胞的收集：于傳代后的12 h第一次收集細(xì)胞，而后每隔12 h收集一次，最后一次收集為傳代后的72 h，將所收細(xì)胞凍存于超低溫冰箱備用。病毒液的收集：于接毒后的12 h第一次收集病毒液，而后每隔12 h收集一次，最后一次收集為接毒后的72 h，將所收病毒液凍存于超低溫冰箱備用。

1.5.3 核酸的準(zhǔn)備 RNA抽提試劑盒抽提試驗(yàn)組和對照組總RNA，經(jīng)核酸蛋白儀測定濃度，0.1%DEPC水調(diào)定RNA濃度一定后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，凍存于超低溫冰箱備用。

1.5.4 自噬相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄的測定 利用本文建立的Beclin1、ATG5及ATG12實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法分別對“1.5.3”中試驗(yàn)組和對照組cDNA進(jìn)行熒光定量檢測。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量方法的建立

2.1.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 優(yōu)化后的反應(yīng)條件：反應(yīng)體系25 μL，其中上、下游引物各1 μL,質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品2 μL，SYBR Green Premix ExTaqⅡ12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足到25 μL；退火溫度均為56 ℃；反應(yīng)采用的三步法：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。

2.1.2 自噬相關(guān)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 如圖1顯示，標(biāo)準(zhǔn)品與其對應(yīng)的Ct值線性關(guān)系良好，Beclin1、ATG5及ATG12相關(guān)系數(shù)R2分為0.998、0.998、0.999，斜率Slope分別為-3.485、-3.347、-3.571，y軸截距分別為34.614、33.778、34.357，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=-3.485x+34.614，y=-3.347x+33.778，y=-3.571x+34.357。

A.Beclin1；B.ATG5；C.ATG12圖1 自噬相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curves of the real-time PCR of autophagy-related genes

2.2 PRRSV SC株一步生長曲線的繪制及自噬相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄量的檢測

2.2.1 PRRSV SC株一步生長曲線的繪制 PRRSV SC 株熒光定量檢測方法由本實(shí)驗(yàn)室自行建立[16]。利用所建方法分別對0、4、8、12、24、36、60、84 h的病毒含量進(jìn)行測定，繪制PRRSV SC 株一步生長曲線(圖2)：8 h前PRRSV增殖緩慢，8～24 h病毒進(jìn)入對數(shù)增殖期，在24～60 h達(dá)到平穩(wěn)期，60～84 h病毒增殖快速下降。PRRSV感染Marc145細(xì)胞后，由于細(xì)胞量相對充足，病毒在8～24 h快速增殖，60 h后由于細(xì)胞大量病變、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，病毒增殖速度明顯降低。

圖2 PRRSV SC株在Marc145細(xì)胞中的一步生長曲線Fig.2 The one-step growth curve of PRRSV SC strain in Marc145 cell

2.2.2 自噬相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄量的檢測將對照組和試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Ct值記錄整理，利用所建立方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線將Ct值換算為拷貝數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，拷貝數(shù)對數(shù)為縱坐標(biāo)，作拷貝數(shù)對數(shù)-時(shí)間的線性曲線圖，其中拷貝數(shù)對應(yīng)的絕對值為細(xì)胞數(shù)量。如圖3所示，具有自噬啟動作用的Beclin1 mRNA在感染PRRSV SC株前后轉(zhuǎn)錄量存在明顯差異，感染后PRRSV使Beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄量增加，且在12 h時(shí)其轉(zhuǎn)錄量已明顯高于對照組。感染后12～48 h期間Beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄量呈直線增加，48 h后其轉(zhuǎn)錄量增加緩慢，但仍高于對照組。如圖4所示，試驗(yàn)組和對照組的ATG5 mRNA在36 h前轉(zhuǎn)錄差異不大，48 h時(shí)試驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄增多，并在72 h前保持持續(xù)增加，對照組從48 h時(shí)轉(zhuǎn)錄量雖有增加，但增加量較試驗(yàn)組低。圖5顯示，試驗(yàn)組與對照組ATG12 mRNA增長趨勢差異不大，試驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄量在60 h時(shí)達(dá)到峰值，而后開始下降；對照組轉(zhuǎn)錄量則從24 h時(shí)開始增加，持續(xù)增加至72 h。對試驗(yàn)組與對照組的基因轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行組間方差分析，結(jié)果顯示，Beclin1(P=0.005<0.01)差異極顯著，ATG5(0.01

圖3 Beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄量拷貝數(shù)線性曲線圖Fig.3 Linear curve of copy number of Beclin1 mRNA expression

圖4 ATG5 mRNA轉(zhuǎn)錄量拷貝數(shù)線性曲線圖Fig.4 Linear curve of copy number of ATG5 mRNA expression

圖5 ATG12 mRNA轉(zhuǎn)錄量拷貝數(shù)線性曲線圖Fig.5 Linear curve of copy number of ATG12 mRNA expression

3 討 論

自噬相關(guān)基因?qū)τ谧允傻陌l(fā)生及調(diào)控至關(guān)重要，了解相關(guān)基因在通路中的功能作用，對于自噬研究十分必要。Beclin1基因作為細(xì)胞自噬的啟動基因和調(diào)控基因，其在乳腺癌[17-18]等疾病的發(fā)生中，常表現(xiàn)為下調(diào)，而在胃癌、肝癌疾病過程中，卻表現(xiàn)為明顯上調(diào)。在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，研究人員對Beclin1的檢測結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄量降低[19-20]。Beclin1參與許多疾病過程，也與病毒感染關(guān)系密切。已有研究表明PRRSV感染細(xì)胞后，Beclin1能通過調(diào)節(jié)其他ATG蛋白的定位對自噬活性進(jìn)行調(diào)節(jié)[21]。但Beclin1在細(xì)胞內(nèi)如何被因子調(diào)控，PRRSV的變異對其表達(dá)有怎樣的影響等此類問題目前并不清楚。ATG5與ATG12在自噬發(fā)生過程中常形成復(fù)合物，能通過促進(jìn)LC3蛋白脂質(zhì)化從而促進(jìn)細(xì)胞自噬，并對細(xì)胞抗病毒天然免疫也有積極作用[22]。細(xì)胞自噬在一定程度上能增強(qiáng)抵御病毒感染的能力，研究ATG5與ATG12對揭示細(xì)胞天然免疫，增強(qiáng)細(xì)胞抗病毒能力具有重要意義。

本研究對對照組和試驗(yàn)組的自噬相關(guān)基因mRNA進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc145細(xì)胞后使Beclin1、ATG5、ATG12 mRNA的轉(zhuǎn)錄量增加，且三個(gè)基因 mRNA轉(zhuǎn)錄量在較長時(shí)間內(nèi)一直持續(xù)在較高水平，與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達(dá)量符合[23]。PRRSV在60 h左右達(dá)到增殖峰值，而此時(shí)刻相關(guān)基因的mRNA也處于持續(xù)較高轉(zhuǎn)錄量的狀態(tài)，這與陳全剛[24]得出的PRRSV能利用細(xì)胞自噬促進(jìn)自身增殖相符合，也與Rab11a以自噬方式幫助PRRSV結(jié)果相一致。對照組細(xì)胞在維持36 h左右后相關(guān)基因 mRNA轉(zhuǎn)錄量開始升高，但與試驗(yàn)組相比仍相對較低，推測在維持狀態(tài)的Marc145細(xì)胞在36 h左右已開始發(fā)生自噬，在48～72 h時(shí)相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄量穩(wěn)定在稍高水平，且仍有隨時(shí)間推移繼續(xù)升高的趨勢，可能是發(fā)生自噬后細(xì)胞雖能利用自噬物質(zhì)暫時(shí)維持自身代謝活動，但由于環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗殆盡發(fā)生了廣泛的自噬，后期自噬增強(qiáng)逐漸發(fā)展為凋亡。PRRSV在24 h時(shí)快速增殖，病毒量在24～60 h均處于較高狀態(tài)，結(jié)合自噬基因轉(zhuǎn)錄水平可以基本說明PRRSV增殖與細(xì)胞自噬在一定程度范圍內(nèi)呈正向作用，即PRRSV能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并利用自噬產(chǎn)物幫助自身增殖。

本研究雖發(fā)現(xiàn)了Beclin1、ATG5與ATG12 mRNA的轉(zhuǎn)錄規(guī)律、PRRSV 增殖與細(xì)胞自噬的相關(guān)聯(lián)系，但病毒增殖與細(xì)胞自噬怎樣相互作用，病毒的變異對細(xì)胞自噬有怎樣的影響等問題仍有待研究。

4 結(jié) 論

PRRSV感染Marc145細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量方法測得Beclin1、ATG5和ATG12 mRNA在感染后轉(zhuǎn)錄量增加；其轉(zhuǎn)錄規(guī)律與細(xì)胞病變、PRRSV增殖規(guī)律呈正相關(guān)。