王璁 李永文 李穎 宮顥 張洪兵 袁茵 李偉婷 劉紅雨 陳軍

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率在全球居各種腫瘤之首，雖然手術、化療、分子靶向治療等治療手段取得了巨大進步，但其5年生存率仍徘徊在15%左右[1]，其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌總量的80%-85%。由于肺癌發(fā)病隱匿，30%-50%的患者在確診時已處于疾病的中晚期，預后極差，5年生存率小于10%。因此，明確肺癌的發(fā)病機理必將對肺癌的診治起到至關重要的作用。自噬（autophagy）是一個進化保守的細胞內(nèi)分解代謝過程，細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)，是真核細胞特有的生命現(xiàn)象?，F(xiàn)有的證據(jù)表明自噬的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切[2]，但是其作用機制還不明?，F(xiàn)有的觀點認為，在腫瘤的早期，自噬可降解有害的蛋白，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制腫瘤的發(fā)展；而在腫瘤的晚期，自噬可促進腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因此，研究自噬在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用是十分必要的。

微管相關蛋白輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3）是哺乳動物細胞中酵母ATG8（Ant7/Apg8）基因的同源物，是自噬的一種標記性基因，其表達水平與自噬活性密切相關，是目前公認的自噬標記基因[3,4]。P62是由原癌基因c-myc編碼的基因表達產(chǎn)物，它可以與泛素化的蛋白質(zhì)相結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運至自噬小體內(nèi)進行降解，因此它是反映自噬活性的標記蛋白。目前，有關LC3和P62在NSCLC中表達情況的研究較少[5-7]。本研究通過免疫組化法聯(lián)合檢測LC-3、P62在NSCLC組織中的表達情況，分析其與腫瘤病理生理特征的關系，以探討自噬在肺癌發(fā)生發(fā)展及預后中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象及臨床資料 以2011年6月-2013年9月期間在天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科行肺癌切除術的患者，經(jīng)術后病理組織學檢查確診為原發(fā)性NSCLC，且術前未經(jīng)放療、化療和分子靶向治療，共收集患者66例。病人的數(shù)據(jù)請見表1，包括年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）第八版臨床分期標準將患者的進行TNM分期。共包含男性46例，女性20例，年齡47歲-76歲，中位年齡61歲。其中腺癌45例，鱗癌21例。術后平均隨訪48.5個月（3個月-96.5個月），生存數(shù)據(jù)截止到2014年7月。這項研究通過了本院倫理委員會批準并取得患者的知情同意。

1.2 免疫組織化學方法 66例肺癌組織標本均由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科常規(guī)固定、石蠟包埋，切片。4 μm-6 μm厚的石蠟病理切片，70 ℃烤片40 min，脫蠟，脫水后，經(jīng)Tris/EDTA修復液（pH 8.0）進行抗原修復，正常羊血清RT封閉30 min，加入一抗4 ℃過夜，經(jīng)生物素化的二抗37 ℃ 30 min，辣根酶標記的鏈霉素卵白素工作液37 ℃ 30 min，DAB顯色液顯色，蘇木素復染。LC-3和P62抗體均購自Cell Signaling Technology，兔抗人單克隆抗體，經(jīng)稀釋液1:100稀釋后使用。陽性對照由試劑公司提供，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學結(jié)果判定 每張切片隨機選取10個高倍（400×）視野，每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞比例評判實驗結(jié)果。所有染色結(jié)果均由兩位病理醫(yī)生對患者的臨床病理信息沒有事先了解的情況下給出分數(shù)，然后在討論后達成共識。對LC-3和p62染色強度和范圍進行評分。根據(jù)染色強度分級為0（無染色）、1（輕度染色）、2（中度染色）、3（強染色）。根據(jù)染色的腫瘤細胞的百分比，評分如下：0（＜10%）、1（10%-49%），2（≥50%）。將兩個得分相乘得到最終的結(jié)果，陽性（≥2）或陰性（＜2）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包（IBM公司，美國）對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。運用卡方檢驗來分析LC-3和p62的表達與臨床病理生理特征的關系。采用單變量和多變量Cox比例風險模型計算患者的危險比和95%CI。生存分析采用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LC-3與P62蛋白在NSCLC組織中的表達 如圖1所示，LC-3、P62陽性染色呈棕黃色或者黃褐色顆粒，在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，陽性染色細胞排列呈巢狀，周圍被結(jié)蹄組織分割，另可見部分患者的細胞排列成腺腔樣。在66例NSCLC患者中，27例LC-3染色陽性，陽性表達率為40.9%（27/66）；43例P62染色陽性，P62的陽性表達率為65.2%（43/66）。

2.2 LC-3與P62蛋白表達與NSCLC臨床病理因素的關系如表1所示，我們進一步對LC-3和P62的表達情況與患者的臨床病理生理特征進行分析，發(fā)現(xiàn)在不同組織學類型的患者中，LC-3和P62的表達情況存在明顯差異：在鱗癌患者中LC-3陽性率為57.14%（12/21），明顯高于其在腺癌患者中的陽性表達率（33.33%, 15/45）（P＜0.05）；而P62卻腺癌患者中的陽性表達率（84.44%, 38/45）明顯高于其在鱗癌患者中的陽性表達率（23.81%, 5/21）（P＜0.05）。在III期-IV期肺癌中P62的陽性表達率（75%,39/52）明顯高于其在I期-II期存肺癌中的表達（28.57%,4/14）（P＜0.001）；在不同轉(zhuǎn)移狀態(tài)的病人中，LC-3和P62的表達情況存在顯著性差異：在有轉(zhuǎn)移的患者中LC-3的陽性表達率僅為34%（17/50），明顯低于其在無轉(zhuǎn)移的患者中（62.5%, 10/16）（P＜0.001）；而P62的陽性表達率在有轉(zhuǎn)移的患者中為58%（29/50），雖然仍然明顯低于其在無轉(zhuǎn)移患者中的陽性表達率（87.5%, 14/16）（P＜0.001）， 但卻明顯高于LC-3在有轉(zhuǎn)移患者中的陽性表達情況。

2.3 LC-3與P62蛋白在NSCLC中表達的相關性 如表2所示，應用Spearman相關性分析顯示：在66例NSCLC患者中，LC-3與P62均陽性者9例，LC-3與P62均陰性者5例，LC-3陽性P62陰性者18例，LC-3陰性P62陽性者34例，二者表達呈負相關（rs=-0.065,P＜0.001）。

2.4 LC-3和P62表達與其臨床預后之間的關系 如圖2所示，應用Kaplan-Meier法對66例患者進行生存分析發(fā)現(xiàn)，LC-3蛋白陽性表達的患者預后明顯好于其陰性表達的患者（39.1個月vs16.3個月，P=0.0196）；而P62蛋白表達水平卻與患者的預后未見明顯的相關性（陽性患者27.8個月vs陰性患者29.2個月，P=0.1629）。

3 討論

自噬是一種溶酶體依賴性的高效亞細胞降解途徑，是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種基本生命現(xiàn)象，它通過溶酶體將細胞多余的或無功能的物質(zhì)降解，從而達到保護細胞內(nèi)蛋白代謝平衡，調(diào)節(jié)細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)等目的[8]。許多研究表明，自噬對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能起雙重作用[9-11]。一方面，自噬通過維持腫瘤細胞內(nèi)營養(yǎng)及微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)使得腫瘤細胞可以持續(xù)獲得能量供給，有促進腫瘤生長的作用；另一方面，自噬通過多種自噬標記性因子激活不同的細胞信號調(diào)節(jié)通路，使得腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡，從而達到抑制腫瘤生長的作用。此外，自噬可導致腫瘤細胞對放療、化療和靶向治療的耐受和治療失敗，從而導致腫瘤的進展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移。

表 1 LC-3和P62在66例NSCLC中的表達情況和其臨床特征分析Tab 1 The expression of LC-3 and P62 in 66 lung cancer patients and their clinical characteristics

圖 1 LC-3和P62免疫組化結(jié)果示意圖。A-B：LC-3在肺癌組織中陰性表達情況（A）和陽性表達情況（B）；C-D：P62在肺癌組織中陰性表達情況（C）和陽性表達情況（D）（×400）。Fig 1 The immunohistochemistry staining results of LC-3 and P62 in lung cancer.A-B: The expression of LC-3 in lung cancer with negative situation (A) and positive situation(B); C-D: The expression of P62 in lung cancer with negative situation (C) and positive situation(D) (×400).

表 2 LC-3和P62表達相關性分析Tab 2 Correlation analysis of LC-3 and P62 expression

LC-3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，能定位于自噬體膜，參與自噬的形成，其表達產(chǎn)物有LC3 I型和LC3 II型兩種形式。當自噬發(fā)生時，LC3I型經(jīng)泛素樣加工修飾后與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3 II型。LC3 II型蛋白結(jié)合并定位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡的多少呈正比，可以間接反映細胞自噬水平的高低，是自噬的標記性分子[12]。P62是原癌基因C-myc編碼，在細胞質(zhì)中合成，隨后表達于細胞核內(nèi)的一種磷酸化蛋白質(zhì)。P62可以與泛素化的蛋白質(zhì)及自噬體膜上的LC-3 II蛋白形成復合物，在自噬溶酶體內(nèi)完成降解過程[13]。在自噬過程發(fā)生時，P62在細胞質(zhì)內(nèi)被不斷的降解，P62表達降低；當自噬流受阻時，P62蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)聚集，表達量升高，因此，P62是一種可以反映自噬流活性的標記蛋白。

本研究結(jié)果顯示，在NSCLC中，LC-3的陽性表達率為40.9%，在腺癌患者及有轉(zhuǎn)移的患者中，LC-3的表達陽性率顯著性低于鱗癌患者及無轉(zhuǎn)移的患者，而LC-3較低表達的患者總體預后差，提示在NSCLC中，存在LC-3的表達異常并與患者的預后相關。Liu等的研究[14]結(jié)果顯示，在NSCLC中LC-3的下調(diào)與患者的病理類型及遠處轉(zhuǎn)移情況有關，這與我們的研究結(jié)果一致。對于P62來說，在NSCLC中的陽性表達率為65.2%，在腺癌患者，TNM分期III期、IV期及無遠處轉(zhuǎn)移的患者中P62的陽性表達率顯著增高。進一步分析顯示，P62與LC-3在NSCLC中的表達呈負相關（rs=-0.145,P＜0.01）。上述結(jié)果表明NSCLC組織中存在LC-3和P62表達異常，提示自噬可能介導NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程。

圖 2 Kaplan-Meier生存曲線分析。A：LC-3蛋白表達的生存曲線分析； B：P62蛋白表達的生存曲線分析。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis.A: Survival curve analysis of LC-3 protein expression; B: Survival curve analysis of P62 protein expression.

綜上所述，NSCLC中存在自噬相關蛋白LC-3和P62的表達異常，其表達情況與腫瘤的病理類型、臨床分期及是否存在轉(zhuǎn)移相關，提示自噬參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程，但其具體的作用機制仍需要進一步探討。