韓永勝，佟桂芝 ，王洪寶，李信濤，宋 斌

（1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130000）

國外采用性控凍精進(jìn)行體外性控胚胎生產(chǎn)的研究較早，目前囊胚率能達(dá)到50%左右［1-2］。我國在該領(lǐng)域研究起步較晚，但國內(nèi)學(xué)者通過不斷改善優(yōu)化牛體外性控胚胎的生產(chǎn)體系，目前體外受精囊胚率已達(dá)到25%左右［3-5］。針對牛良種快速擴(kuò)繁的實(shí)際需求及采用性控凍精體外受精生產(chǎn)性控胚胎效率較低、成本較高的現(xiàn)狀，該試驗(yàn)系統(tǒng)比較了卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞的脫除方式對性控精液體外受精性控胚胎發(fā)育率的影響，旨在為提高體外性控牛胚胎生產(chǎn)效率提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

試驗(yàn)中所涉及的生化試劑除特別標(biāo)注外均購自Sigma公司。

1.2 卵母細(xì)胞的收集

在牛屠宰場，用無菌剪刀剪取剛屠宰后牛的新鮮卵巢，用含1 000 IU/L青霉素和1 000 IU/L鏈霉素的滅菌生理鹽水沖洗干凈，放入含有雙抗的32℃生理鹽水中，在2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。用無菌剪刀剪掉周圍的脂肪等組織后用預(yù)熱且加有雙抗的生理鹽水沖洗牛卵巢3次以上，用10mL帶有12﹟針頭的一次性注射器抽取卵巢上直徑為2～8 mm卵泡的卵泡液，獲得的卵泡液置于15 mL離心管內(nèi)，放在預(yù)熱至38.5℃的恒溫臺。分別取直徑3.5 cm培養(yǎng)皿4個、直徑9 cm培養(yǎng)皿2個，將直徑9 cm培養(yǎng)皿底部劃上寬度間隔約為0.7 cm的直線。將含有COCs的采卵液（15 mL離心管內(nèi)）倒入培養(yǎng)皿中，并輕輕搖勻。然后在體視顯微鏡下收集卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體 （cumulus oocyte complex，COCs），并移入盛有抽卵液的直徑3.5 cm培養(yǎng)皿中。形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻和卵丘細(xì)胞不低于3層的COCs為可用，用預(yù)平衡的卵母細(xì)胞成熟液清洗5次。采卵液配方：mPBS（0.665 g/L肝素鈉、10%FBS、100 IU/L 青霉素、100 IU/L 鏈霉素）。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟

在體視鏡下檢出卵母細(xì)胞，然后選出A、B級卵母細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱預(yù)平衡2 h以上，4孔培養(yǎng)板進(jìn)行體外成熟（500 μL/孔），每孔放 50 枚 A、B級卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。成熟液TCM-199［10 μg/mL 促性腺激素 （FSH）、8%胎牛血清（FCS）、1 μg/mL 雌二醇 （E2）、10 μg/mL 促黃體激素（LH）、1 mmol/L L-谷氨酰胺、20 ng/mL EGF、100 μmol/L半胱氨酸］，體外成熟24 h。培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.4 精子獲能及體外受精

1.4.1 精子離心獲能法：牛性控冷凍精液在38℃水浴中解凍15 s，然后將解凍后的精液貼壁緩慢加入獲能液，然后進(jìn)行離心（2 000 r/min，5 min），一次離心體外獲能法在此時(shí)去上清液后，直接用受精液將精子密度稀釋至1×106個/mL用于體外受精，性控精子體外獲能液為BO液（10mg/L咖啡因、5 μmol/L 抗壞血酸、3 mg/mL BSA）。

1.4.2 體外受精：受精前2 h做好受精液小滴，每滴50 μL，放入CO2培養(yǎng)箱中平衡。在精子處理的同時(shí)，用200 μL移液器反復(fù)吹打培養(yǎng)成熟的COCs，使卵子間相互分離。洗滌5次后，將20個COCs移入受精液滴中。然后將培養(yǎng)皿放入38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外受精。體外受精液為BO液 （0.665 g/L肝素鈉、10mg/L咖啡因、5 μmol/L 抗壞血酸、3 mg/mL BSA）。

1.5 體外胚胎發(fā)育培養(yǎng)（IVC）

1.5.1 胚胎發(fā)育液預(yù)平衡：在4孔培養(yǎng)板上標(biāo)記組別、日期，每孔放入胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液600 μL，覆蓋石蠟油。另取1.5 mL離心管，吸取1 mL的胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液放入離心管中，做好標(biāo)記。將4孔培養(yǎng)板和離心管放入38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，預(yù)平衡2 h。胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液配方：mCR1aa液+3 mg/mL BSA；胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅱ液配方：mCR1aa液+10%FBS。 其中，mCR1aa為 2%的必需氨基酸+1%的非必需氨基酸+2 mmol/L的谷氨酰胺。

1.5.2 脫除精子及卵丘細(xì)胞：精子與卵子受精培養(yǎng)8 h，將假定的受精卵移入mCR1aa液中洗滌3次，試驗(yàn)1組用吸管輕輕反復(fù)抽吸，以除掉卵丘細(xì)胞和黏附在受精卵上的精子；試驗(yàn)2組用0.1%透明質(zhì)酸酶液處理5 min；對照組用振蕩法將假定受精后的受精卵移入5 mL離心管 （內(nèi)裝2 mL mCR1aa， 已經(jīng)預(yù)平衡 2 h），2 000 r/min、 離心 5 min。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別用不同的方法脫除卵丘細(xì)胞。然后在胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液（預(yù)先在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h）中洗滌3次后，然后按每滴50個卵子移入4 孔培養(yǎng)板 500 μL 的 IVC 液中，在 5%O2、5%CO2、90%N2，飽和濕度條件下進(jìn)行早期胚胎體外培養(yǎng)。

1.5.3 更換培養(yǎng)液：受精卵于受精48 h統(tǒng)計(jì)胚胎卵裂率后轉(zhuǎn)移至600 μL的胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅱ液中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔2 d后半量換胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅱ液。4孔培養(yǎng)板放入38.5℃、飽和濕度的5%O2、5%CO2、90%N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于受精第7～8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，體外受精8 h后，采用不同的脫除卵丘細(xì)胞方式（機(jī)械脫除法、酶脫除法、振蕩法）脫除卵丘細(xì)胞，受精卵經(jīng)體外培養(yǎng)后48 h統(tǒng)計(jì)胚胎 卵裂 率分別 為 （58.8±2.8）%、（58.5±5.7）%、（69.9±3.4）%，體外培養(yǎng)192 h統(tǒng)計(jì)囊胚率分別為（26.7±2.7）%、（26.9±3.9）%、（35.8±4.1）%。 結(jié)果表明，振蕩法顯著優(yōu)于機(jī)械脫除法和酶脫除法 （P<0.05）。

3 討論

卵丘細(xì)胞通過自分泌和旁分泌的方式影響牛體外受精效果［6-8］。在體外受精前，成熟卵母細(xì)胞部分脫除卵丘細(xì)胞組，體外受精胚胎卵裂率顯著高于不脫除卵丘細(xì)胞組（P<0.05）。卵丘細(xì)胞在牛卵母細(xì)胞體外受精過程中有著許多重要作用，其中包括吸引、阻絆和選擇精子［7-9］，活力弱的精子在其阻絆下一般很難接近卵母細(xì)胞。體外受精（IVF）培養(yǎng)8 h后，對照組卵丘細(xì)胞胚胎卵裂率、囊胚率顯著高于試驗(yàn)2組（P＜0.05），且對照組的囊胚率最高，但與試驗(yàn)1組囊胚率相比差異不顯著（P>0.05）。透明質(zhì)酸酶作為商品化生物試劑，其生物活性不穩(wěn)定，對貯存條件要求較高，消化卵丘細(xì)胞時(shí)易對卵母細(xì)胞造成傷害，且添加透明質(zhì)酸酶后也需要機(jī)械人工吹打，如果吹打力度不夠可能會導(dǎo)致不能輕易脫掉卵丘細(xì)胞，力度過大又會造成卵母細(xì)胞傷害或死亡；采取人工機(jī)械吹打脫除卵丘細(xì)胞，目前由于缺乏專業(yè)的操作裝置，操作起來比較耗時(shí)且效率較低，操作時(shí)間過長時(shí)卵母細(xì)胞在外界操作環(huán)境時(shí)間就越長，容易造成卵母細(xì)胞大量死亡或者影響卵母細(xì)胞后期發(fā)育。該試驗(yàn)結(jié)果表明，對照組胚胎卵裂率顯著高于試驗(yàn)2組（P＜0.05），且對照組的囊胚率最高，但與試驗(yàn)1組相比差異不顯著（P>0.05）。這可能是因?yàn)樵谟?.1%透明質(zhì)酸酶完全脫除卵丘細(xì)胞的過程中，對胚胎的透明帶造成了損傷，進(jìn)而影響了胚胎的卵裂率及囊胚的發(fā)育能力。該試驗(yàn)結(jié)果與趙學(xué)明等［4］的試驗(yàn)中，卵丘細(xì)胞完全脫除組的胚胎卵裂率（37.5±2.8）%顯著低于卵丘細(xì)胞部分脫除組（67.0±4.7）%（P<0.05）結(jié)果相似。這可能是因?yàn)樵谟?.1%透明質(zhì)酸酶完全脫除卵丘細(xì)胞的過程中，對卵母細(xì)胞的透明帶造成了損傷，進(jìn)而影響了卵母細(xì)胞的受精能力。

表1 不同脫除卵丘細(xì)胞方式對牛體外性控胚胎發(fā)育的影響

4 結(jié)論

性控冷凍精子體外受精生產(chǎn)體外胚胎，體外受精后宜采用振蕩法脫除卵丘細(xì)胞以達(dá)到體外高效生產(chǎn)牛體外性控胚胎的目的。