修朋程 李騰 李雅林 劉紀(jì)豪 李棟 劉有旺

摘 要：目的 探討泰山山慈菇對(duì)小鼠肝癌的免疫治療作用。方法 本課題首先制備泰山山慈菇提取液，體外用山慈菇提取液對(duì)H22肝癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分為空白組、山慈菇提取液低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶陽(yáng)性對(duì)照組，干預(yù)12 h后，Annexin V和7-AAD染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)制備小鼠H22實(shí)體瘤肝癌模型，將50只小鼠分為山慈菇低、中、高劑量組、5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組，每組10只。山慈菇各劑量組均進(jìn)行灌胃治療，模型組灌胃等體積生理鹽水，5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行等體積腹腔注射。連續(xù) 10 d，停藥后次日摘取小鼠眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，檢測(cè)小鼠腫瘤大小分析對(duì)腫瘤的抑制作用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）和γ-干擾素（IFN-γ）的含量。結(jié)果 泰山山慈菇提取液體外促進(jìn)H22腫瘤細(xì)胞凋亡且具有劑量依賴性。體內(nèi)抑制H22腫瘤的生長(zhǎng)，增加血清中TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論 泰山山慈菇通過(guò)增加抗腫瘤細(xì)胞因子產(chǎn)生發(fā)揮抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：泰山山慈菇；肝癌；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-2；γ-干擾素

中圖分類號(hào)：R392.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.003

文章編號(hào)：1006-1959（2018）09-0008-04

Abstract：Objective To investigate the immunotherapy effect of Taishan mountain mushroom on liver cancer in mice.Methods We first prepared the Taishan mountain mushroom extract.In vitro，the H22 hepatoma cells were treated with the extract of mushroom extract in vitro.It was divided into blank group，low，middle and high dose group and 5- fluorouracil positive control group.After 12 h intervention，Annexin V and 7-AAD were stained，and cell apoptosis was detected by flow cytometry.The mice model of H22 solid tumor was prepared in vivo，and 50 mice were divided into low，medium and high dose group，5-Fu positive control group and model control group，with 10 rats in each group.The rats in each dose group were treated by intragastric perfusion，and the model group was given iso-volume intraperitoneal injection of normal saline and 5-Fu positive control group.For 10 d，the mice were killed the next day after extirpation of eyeball and blood，and the inhibitory effect of tumor size analysis on the tumor was detected.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the levels of TNF-α，IL-2 and IFN-γ in serum.Results The extract of Taishan mountain mushroom promoted the apoptosis of H22 tumor cells in a dose-dependent manner.In vivo，the growth of H22 tumor was inhibited and the levels of TNF-α，IL-2 and IFN-γ in serum increased.Conclusion Taishan mountain mushroom plays an anti-tumor role by increasing the production of anti-tumor cytokines.

Key words：Taishan mountain mushroom；Liver cancer；Tumor necrosis factor -α；Interleukin-2；γ-interferon

肝癌是死亡率較高、五年生存率較低、惡性程度極高的腫瘤疾病之一。肝癌的治療主要有手術(shù)、放療、化療等治療方法[1]。放療、化療對(duì)機(jī)體毒副作用較大，探討中藥對(duì)肝癌的治療作用是目前研究的熱點(diǎn)。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一。泰山山慈菇資源豐富，而其藥用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到開發(fā)。據(jù)記載，山慈菇為中國(guó)藥典收載的常用中藥，中醫(yī)臨床上常用于治療乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤等[2，3]，但其對(duì)于肝癌的作用效果鮮有研究，限制其在臨床上的應(yīng)用。其是否通過(guò)增強(qiáng)免疫作用抗腫瘤也不清楚。本研究首先采用醇提法制備泰山山慈菇提取液。體外觀察泰山山慈菇提取液是否對(duì)H22細(xì)胞具有促凋亡作用，在此基礎(chǔ)上制備小鼠H22實(shí)體瘤肝癌模型，體內(nèi)檢測(cè)其對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響及對(duì)血清TNF-α、IL-2和IFN-γ含量的影響，探討其可能的抗腫瘤免疫作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑

1.1.1動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠，鼠齡8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.1.2細(xì)胞及試劑 H22肝癌細(xì)胞株購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒均購(gòu)自eBioscience公司。胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），DMEM液體培養(yǎng)基（Gibco公司），AnnexinV/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Biolegend公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。泰山山慈菇購(gòu)自山東省泰安市金泰聯(lián)藥店。

1.2方法

1.2.1泰山山慈菇乙醇提取液 制備參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[2]，并加以改進(jìn)。制備方法：將150 g泰山山慈菇粉碎，加入500 ml雙蒸水煮沸后過(guò)濾，藥渣再煮2次，合并3次濾液。將3次濾液煎熬濃縮成500 ml，藥液冷卻后，邊攪拌邊緩慢加入無(wú)水乙醇至藥液含醇量為50%～60%，4 ℃密封48 h后過(guò)濾，然后用95%乙醇洗滌沉淀，收集濾液。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收得深棕色浸膏。用DMEM培養(yǎng)基溶解成10 mg/ml的溶液，0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌后分裝存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將H22細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將傳代后2 d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105 cells/ml密度接種于96孔平底培養(yǎng)板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分成5組（空白對(duì)照組，5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組，山慈菇低、中、高劑量組），每組5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入5-Fu（終濃度0.5 mg/ml），泰山山慈菇低、中、高劑量組（終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml），空白組加入等體積培養(yǎng)基。處理12 h后，按照AnnexinV/7-AAD試劑盒說(shuō)明書操作，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理及染色，流式細(xì)胞儀（AriaⅡ，BD公司）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.3小鼠H22肝癌模型的建立 參照文獻(xiàn)方法[4]，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H22肝癌細(xì)胞，于細(xì)胞對(duì)數(shù)期收集細(xì)胞，用生理鹽水將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107 cells/ml制成細(xì)胞懸液，接種200 μl于小鼠右腋窩皮下，接種后出現(xiàn)米粒大的鼓包視為接種成功。

1.2.4動(dòng)物分組及處理 將小鼠分為模型組，山慈菇多糖低、中、高劑量組，5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。模型組接種H22肝癌細(xì)胞24 h后，灌胃0.2 ml生理鹽水，泰山山慈菇低、中、高劑量組分別灌胃300 mg/kg、600 mg/kg和900 mg/kg山慈菇提取液0.2 ml，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃5-Fu 25 mg/kg溶液0.2 ml。1次/d，連續(xù)給藥10 d。

1.2.5抑瘤率的檢測(cè) 停藥后次日，摘眼球取血后，頸椎脫臼處死小鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量瘤塊重量，計(jì)算各組平均瘤塊重量及抑瘤率，抑瘤率（%）=[1-（給藥組平均瘤重/模型對(duì)照組平均瘤重）]×100%。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量 停藥次日摘除眼球法取血，常規(guī)方法分離血清，按照小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒說(shuō)明操作，酶標(biāo)儀（Tecan，Infinite M200 Pro）測(cè)定小鼠血清中TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1泰山山慈菇對(duì)H22肝癌細(xì)胞早期凋亡作用的影響 為了探討泰山山慈菇是否具有抗肝癌的作用，我們首先培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞，然后用泰山山慈菇處理H22肝癌細(xì)胞，Annexin V、7-AAD染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)藥物處理細(xì)胞12 h后，5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率為27.00%，高于空白對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。泰山山慈菇低、中、高劑量組細(xì)胞早期凋亡率分別為15.80%、20.20%和25.40%，均高于空白對(duì)照組自發(fā)凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。其中高劑量組細(xì)胞早期凋亡率與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。結(jié)果見圖1。本研究結(jié)果提示，泰山山慈菇體外可以通過(guò)促進(jìn)H22肝癌細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.2泰山山慈菇對(duì)H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響 為了探討泰山山慈菇體內(nèi)是否對(duì)肝癌有治療作用，我們首先建立了H22荷瘤小鼠模型，然后灌胃不同劑量的泰山山慈菇進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組抑瘤率達(dá)50.63%，與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。山慈菇低、中、高劑量組對(duì)小鼠肝癌的抑瘤率分為30.95%、38.67%、45.53%。與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著劑量的增加，抑瘤率增加，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，其中高劑量組抑瘤率稍低于陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果見表1。本研究提示泰山山慈菇對(duì) H22 荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

2.3泰山山慈菇對(duì)H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2和IFN-γ含量的影響 為了探討泰山山慈菇抗肝癌的免疫相關(guān)機(jī)制，我們采用ELISA方法檢測(cè)了小鼠血清中可能與抗腫瘤有關(guān)的幾種細(xì)胞因子的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組小鼠相比，5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組可增加荷瘤小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）；泰山山慈菇低、中、高劑量均可提高荷瘤小鼠的血清TNF-α、IL-2和IFN-γ含量，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，結(jié)果見表2。本研究提示，泰山山慈菇可能通過(guò)增加抗腫瘤細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮抗肝癌作用。

3討論

肝癌是死亡率較高的腫瘤疾病之一，其惡性程度極高，五年生存率僅10.1%，是我國(guó)人群主要癌癥中最低的[1]。目前，肝癌的治療主要有手術(shù)、放療、化療等治療方法。放療、化療對(duì)機(jī)體毒副作用較大，探討中藥對(duì)肝癌的治療作用是一個(gè)有前景的研究方向。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一。山慈菇在臨床上以復(fù)方的形式廣泛應(yīng)用于口腔癌、食管癌、胃癌、甲狀腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的治療[2]，其是否對(duì)肝癌有治療作用及作用的免疫機(jī)制并不十分清楚。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是目前研究最為熱點(diǎn)的中藥抗腫瘤機(jī)制之一，而凋亡也是中藥抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一條很重要的途徑[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，泰山山慈菇提液體外可誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞早期凋亡，且具有劑量依賴性，其中高劑量組與5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組作用相當(dāng)，提示泰山山慈菇體外可以通過(guò)促進(jìn)H22肝癌細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

我們進(jìn)一步探討了泰山山慈菇體內(nèi)是否對(duì)肝癌有治療作用，通過(guò)建立了H22荷瘤小鼠模型，然后灌胃不同劑量的泰山山慈菇進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泰山山慈菇可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，且具有劑量依賴性，其中高劑量組抑瘤率與5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。提示泰山山慈菇對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能是目前抗腫瘤治療的主要方法之一，進(jìn)一步我們探討了泰山山慈菇抗肝癌的可能的免疫作用機(jī)制。我們采用ELISA方法檢測(cè)了小鼠血清中可能與抗腫瘤有關(guān)的幾種細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量。IL-2 參與細(xì)胞免疫，能夠通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞增殖和分化等作用提高機(jī)體的免疫功能[6]。本研究結(jié)果表明，泰山山慈菇提取液可增加荷瘤鼠血清中的IL-2水平，效果與5-Fu相當(dāng)，表明其可能增強(qiáng)H22荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫。TNF-α具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其溶解、增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)等作用，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。本研究結(jié)果表明，泰山山慈菇提取液能明顯提高H22荷瘤鼠血清TNF-α水平，由此可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤生長(zhǎng)。IFN-γ是一種糖蛋白，主要由輔助性T細(xì)胞（Th1）和自然殺傷（NK）細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，能增強(qiáng)細(xì)胞功能[7，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，泰山山慈菇提取液能明顯提高H22荷瘤鼠血清IFN-γ水平，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果表明泰山山慈菇提液可通過(guò)提高H22荷瘤鼠的血清IL-2、TNF-α和IFN-γ水平，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫力，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，但其具體機(jī)理尚有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道較一致且更加完善[6，8]。

綜上所述，本研究為臨床使用山慈菇抗肝癌提供了理論依據(jù)。山慈菇的藥理作用及抗癌機(jī)制目前研究得還不夠充分，還有待進(jìn)一步深入的研究。

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收稿日期：2018-1-8；修回日期：2018-3-9

編輯/楊倩