李 耀，何葉子，陳光靜,2,3，闞建全,2,3,*

花椒（Zanthoxylum bungeanum）含有多種生理活性成分，如揮發(fā)油類、生物堿類和酰胺類物質(zhì)，目前從花椒中分離純化得到的酰胺類物質(zhì)主要是α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素及其羥基山椒素（圖1），這類酰胺物質(zhì)被稱為花椒麻味物質(zhì)（numb-taste components of Z. bungeanum，NTCZB），山椒素是最能代表花椒引起麻刺感的成分。NTCZB具有麻醉、抑菌、祛風(fēng)除濕、殺蟲和抗氧化等功效，具有很好的應(yīng)用價值[1-2]。但NTCZB在空氣中不穩(wěn)定，目前還沒有市售的標(biāo)準(zhǔn)品，傳統(tǒng)分離純化方法存在繁瑣、成本高等缺點，而NTCZB的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、含量等方面還有待深入研究，因此迫切需要研究出NTCZB更加高效的分離純化方法[3-4]。分子印跡技術(shù)為NTCZB的分離純化提供了新的思路。在分子印跡技術(shù)中，采用與印跡分子結(jié)構(gòu)相似的化合物作為替代模板分子，可以解決一些印跡分子難獲得、溶解性差等問題[5-6]。用替代模板分子制備的分子印跡聚合物（molecular imprinting polymers，MIPs）對目標(biāo)印跡分子仍具有較好的印跡效果[7-8]。近些年替代模板分子印跡技術(shù)快速發(fā)展，但目前鮮見有關(guān)采用替代模板分子制備NTCZB的MIPs相關(guān)報道。

NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品制備過程繁雜、成本高，其分子鏈上的多個不飽和碳碳雙鍵容易發(fā)生共價鍵化學(xué)反應(yīng)，使NTCZB不易洗脫[9]。為解決上述問題，本實驗采用山椒素的結(jié)構(gòu)類似物（molecular structural analogs of alkyl amides，LM，見圖1d）為NTCZB分子印跡的替代模板分子（理論相對分子質(zhì)量為271），采用本體聚合的方法制備多種NTCZB的MIPs，從中選出對NTCZB的印跡效果最優(yōu)的MIPs，并用其吸附花椒萃取液中的NTCZB，為高純度NTCZB的分離純化奠定基礎(chǔ)，同時也為具有類似結(jié)構(gòu)特點物質(zhì)的分子印跡技術(shù)提供方法借鑒。

圖1 NTCZB主要成分及LM的分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Molecular structures of numb-taste components of Z. bungeanum and structural analogs of alkyl amides

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%），由實驗室按照逆流干柱層析法、制備型高效液相色譜法等工序制備[10]；LM（純度＞95%）由實驗室按照Menozzismarrito等[11]提供的方法制備；鮮花椒 重慶凱揚(yáng)農(nóng)業(yè)有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EDMA）、2-乙烯基吡啶（2-vinylpyridine，2-Vpy）、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、丙烯酰胺（acrylamide，AM）（均為分析純） 阿拉丁公司；偶氮二異丁腈（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）、氯仿、甲醇、冰乙酸、乙腈（均為分析純） 成都科隆試劑公司；實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

DSHZ-300型水浴振蕩儀 蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5810型離心機(jī) 德國艾本德公司；超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；CP214型電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司；UV-260型紫外光譜儀 日本島津公司；Equinox55傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；S-3400N I型掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 LM與功能單體混合溶液的紫外吸收光譜測定[12-13]

分別吸取LM-乙腈溶液100 μL、功能單體（2-Vpy、AM、MAA）的乙腈溶液200 μL及LM與功能單體混合物（物質(zhì)的量比為1∶2）于10 mL比色管中，乙腈定容，超聲10 min后，于4 ℃避光靜置12 h，以乙腈作為參比溶液，在波長190～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2 不同物質(zhì)的量比的功能單體與LM的紫外光譜掃描

固定LM-乙腈溶液1 mL于10 mL比色管中，分別加入功能單體（2-Vpy、AM、MAA）的乙腈溶液，使LM與功能單體物質(zhì)的量比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，乙腈定容，超聲10 min后在4 ℃環(huán)境下避光保存12 h，以相同濃度功能單體為參比溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.3 NTCZB的MIPs制備

MIPs的不同聚合條件見表1。以實驗組編號1為例，聚合物的制備過程具體如下[14]：稱取67.75 mg（0.25 mmol）LM于50 mL圓底燒瓶中，加入12 mL乙腈溶解，然后加1 mmol功能單體MAA，超聲30 min，使其充分溶解，5 ℃避光放置過夜，使LM和功能單體充分作用；加入4 mmol交聯(lián)劑EDMA和10 mg引發(fā)劑AIBN，充分溶解后，向混合液中通氮氣20 min，使瓶內(nèi)保持惰性氛圍，并在氮氣保護(hù)下用封口膜密封燒瓶；于50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合4 h后，再于60 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合20 h，得乳白色塊狀聚合物，將聚合物反復(fù)研磨，過200 目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩；用丙酮自然沉降3 次，棄去上層濁液，以除去聚合物中過細(xì)小的粒子；將沉淀物真空干燥后，以甲醇-乙酸（9∶1，V/V）為洗脫液進(jìn)行索氏提取，直至索氏提取器內(nèi)溶液不含LM為止；再用甲醇反復(fù)洗滌聚合物以去除乙酸，將處理好的MIPs放置于真空干燥箱內(nèi)，40 ℃干燥至恒質(zhì)量，待用。各條件下制備NTCZB的MIPs記為MIPs l～MIPs 16（表1）。作為對照，實驗制備了空白印跡聚合物（non-imprinting polymers，NIPs），其制備方法與MIPs的步驟相同，只是在聚合過程中不加入LM[15]，對應(yīng)樣品記為NIPs l～NIPs 16。

表1 聚合物的制備條件Table 1 Conditions for preparation of polymers

1.3.4 NTCZB高效液相色譜檢測條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]的繪制

高效液相色譜檢測條件：色譜柱-Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，保留時間15 min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測波長254 nm。配制0.01～0.4 mg/mL的NTCZB標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜檢測該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 次檢測結(jié)果中目標(biāo)峰的平均峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，NTCZB標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程：y=17 765x＋125（R2=0.999）。

1.3.5 MIPs的靜態(tài)吸附實驗

稱取50 mg MIPs，置于20 mL具塞錐形瓶中，加入8 mL的一定質(zhì)量濃度的NTCZB-氯仿溶液，于振蕩器上25 ℃、150 r/min振蕩12 h后，倒入10 mL離心管中6 000 r/min離心5 min，移取適量上層清液，微孔濾膜過濾后，高效液相色譜檢測NTCZB濃度，差減法計算該聚合物對NTCZB的吸附量[17]，計算見式（1）：

式中：Q為MIPs的吸附量/（mg/g）；C1為氯仿溶液中NTCZB的原始質(zhì)量濃度/（μg/mL），C0為吸附后上層清液中NTCZB的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為所用氯仿溶液的體積/mL；m為印跡聚合物的質(zhì)量/g。

分子印跡研究中通常用特異因子α表示印跡效果。特異結(jié)合量和特異因子分別定義為式（2）、（3）：

式中：ΔQ為特異結(jié)合量/（mg/g）；QMIPs為MIPs的吸附量/（mg/g）；QNIPs為NIPs的吸附量/（mg/g）；α為特異因子。

1.3.6 MIPs的紅外表征[18]

稱取MIPs和NIPs各10 mg，1 000 mg溴化鉀，研磨充分后于100 ℃烘干至恒質(zhì)量，經(jīng)壓片后，在傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行測定（掃描范圍400～4 000 cm-1）。

1.3.7 MIPs對花椒中NTCZB的分子印跡驗證實驗

取1.0 g粉碎后的花椒粉末置于75 mL氯仿中，于35 ℃、150 r/min振蕩提取12 h，再將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，振搖2 min，靜置分層后，收集氯仿萃取液，定容于100 mL容量瓶中。稱取250 mg MIPs，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL的上述萃取液，于振蕩器上25 ℃、150 r/min振蕩5 h后，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中6 000 r/min離心5 min，收集固體沉淀物，以甲醇為洗脫液對固體沉淀物索氏抽提24 h，將洗脫液濃縮至100 mL，高效液相色譜檢測洗脫液中NTCZB的含量[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3 次，用Origin 8.0和Excel 2003處理實驗數(shù)據(jù)并作圖，結(jié)果以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單體與LM的紫外光譜分析

根據(jù)吸光度加和性，若溶液中各個組分彼此間不發(fā)生作用，則吸光度就等于該溶液中各個組分的吸光度之和，即混合物的理論吸光度，而該混合物的實際吸光度為該混合物溶液在該波長下實測的紫外吸光度，理論吸光度與實際測量值差值越大，表明二者相互作用也越大。

圖2 LM、功能單體及其混合物的紫外吸收光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectra of LM, functional monomer and their mixture

從圖2可以看出，所有樣品的理論吸光度（E1）均大于實際測量值（E2），說明LM與功能單體間發(fā)生了相互作用，原因是LM上存在酰基和羥基，與功能單體形成氫鍵[20]。LM-MAA在波長200 nm處的實測值與理論值差值為0.937±0.095，LM-AM波長200 nm處的實測值與理論值差值為0.977±0.101，LM-2-Vpy波長200 nm處的實測值與理論值差值為1.248±0.138，從差值上可以看出LM與2-Vpy相互作用最大，理論上說，用2-Vpy為功能單體合成的MIPs具有更好的穩(wěn)定性和特異性識別能力[21]。

由圖3A、B、C可知，隨著加入功能單體量的增加，LM和功能單體混合體系的最大吸收峰的吸光度呈上升趨勢，這是因為LM上的—NH—、C=O和—OH基團(tuán)與3 種功能單體上含有的助色團(tuán)和生色團(tuán)相連，產(chǎn)生電子躍遷，使混合體系的最大吸收峰的吸光度增加，同時使最大吸收峰向長波長方向移動，這說明隨著功能單體的加入，LM與相應(yīng)的功能單體通過氫鍵生成了新的復(fù)合物，而該復(fù)合物的穩(wěn)定性直接影響MIPs的吸附效果[22]。吸光度變化趨于平緩時，說明混合物體系趨于穩(wěn)定，此時進(jìn)入平緩區(qū)的轉(zhuǎn)折點所對應(yīng)的混合物比例是最佳的配比[23]，從圖3D可看出，LM與MAA、AM、2-Vpy在對應(yīng)物質(zhì)的量比在1∶4之后吸光度變化均較之前更加平緩，可推斷LM與功能單體物質(zhì)的量比為1∶4可能是聚合的較佳比例。

圖3 不同比例功能單體對預(yù)組裝體系紫外光譜的影響Fig. 3 Effect of different ratios between functional monomers on UV spectrum of preassembled system

差示紫外光譜掃描與不同物質(zhì)的量比的功能單體加入量的紫外光譜掃描實驗方法類似，僅將參比溶液換成相同濃度的LM溶液。LM與2-Vpy相互作用最大，故選擇LM-2-Vpy組裝體系進(jìn)行差示紫外光譜分析，由于功能單體2-Vpy與LM以及其主客體復(fù)合物最大吸收波長在206 nm波長處，參照文獻(xiàn)[24]，LM與功能單體反應(yīng)公式可以推導(dǎo)整理為式（4）：

式中：n為LM和功能單體2-Vpy的結(jié)合比例（n=1，2，3，…）；b0為2-Vpy的濃度；a0為LM的濃度；ΔA為LM與LM-2-Vpy混合物的紫外吸光度差值；K為反應(yīng)平衡常數(shù)。Δε為復(fù)合物與功能單體的摩爾吸光系數(shù)差值；Ι為比色皿厚度。

以ΔA/bn0對ΔA作圖，可以推導(dǎo)出n值，從而得知在乙腈溶液中LM與功能單體的作用模式，進(jìn)而揭示分子印跡作用機(jī)理。以ΔA/bn0對ΔA作圖發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)的量比為1∶1、1∶2時并沒有出現(xiàn)很好的線性關(guān)系，這是由于推導(dǎo)反應(yīng)公式的假設(shè)條件為b0遠(yuǎn)大于a0，即功能單體加入量遠(yuǎn)大于LM，這2 種濃度并不滿足上述假設(shè)條件。因此作線性關(guān)系圖時舍棄這2 種比例。

從圖4可以看出，當(dāng)n為3時，ΔA/bn0對ΔA作圖可以擬合成一條直線（R2=0.963）；當(dāng)n為4時，ΔA/bn0對ΔA作圖也可以擬合成一條直線（R2=0.974），這說明在研究的濃度范圍內(nèi)主客體主要存在形式為1 個LM與3 個或者4 個2-Vpy分子發(fā)生作用，即1 個LM周圍至少需要3 個2-Vpy功能單體才能形成穩(wěn)定的復(fù)合物[25]。

圖4 206 nm波長處ΔA/bn0對ΔA的關(guān)系圖Fig. 4 Plots of ΔA/bn0 versus ΔA at 206 nm

2.2 不同制備條件對MIPs的分子印跡效果的影響

由表2可知，MIPs 1、MIPs 2、MIPs 3對NTCZB的吸附量的大小關(guān)系為MIPs 3＞MIPs 2＞MIPs l，其特異性吸附效果也呈此趨勢，即α3＞α2＞α1。說明以2-Vpy為功能單體時，MIPs 3對NTCZB的印跡效果最好，這與功能單體和LM的紫外光譜分析的結(jié)果吻合。

MIPs 3～MIPs 7對NTCZB的吸附量的大小為MIPs 7＞MIPs 6＞MIPs 3＞MIPs 5＞MIPs 4，其特異性吸附效果為α3＞α5＞α6＞α4＞α7，說明替代模板與2-Vpy物質(zhì)的量比為1∶4時MIPs的印跡效果最好，這與紫外光譜分析研究LM和功能單體相互作用的結(jié)果吻合。

MIPs 8～MIPs 11和MIPs 3對NTCZB的吸附量的大小關(guān)系為MIPs 9＞MIPs 3＞MIPs 10＞MIPs 11＞MIPs 8，其特異性吸附效果為α9＞α3＞α8＞α10＞α11，隨著交聯(lián)劑用量增大，吸附量先增大而后減少，非特異性吸附一直增大，這是因為交聯(lián)劑過量時，易發(fā)生自聚，使所得聚合物內(nèi)的非特異性吸附位點增多，從而造成非特異性吸附量增大[26]，因此實驗選擇功能單體和交聯(lián)劑物質(zhì)的量比為2-Vpy與EDMA 4∶20。

MIPs 9、MIPs 12和MIPs 13的實驗結(jié)果顯示，MIPs 9對NTCZB的吸附量和特異性吸附效果最好，這是由于溶劑用量較小時，溶液中各組分濃度較大，這會使功能單體復(fù)合物被網(wǎng)絡(luò)包裹的程度過于致密，致孔劑不能充分進(jìn)入聚合物網(wǎng)絡(luò)形成大孔結(jié)構(gòu)；溶劑的用量較大時，反應(yīng)溶液濃度較低，自由基引發(fā)聚合反應(yīng)速度減慢，延長了聚合反應(yīng)的時間[17]。MIPs 9、MIPs 14和MIPs 15的結(jié)果表明，其他條件相同時，溫度A條件下制備的MIPs 9對NTCZB的印跡效果最好。

MIPs 9、MIPs 16對NTCZB的吸附量的大小關(guān)系為MIPs 9＞MIPs 16，其特異因子α也呈此趨勢，即MIPs 9的印跡效果優(yōu)于MIPs 16，這是因為聚合反應(yīng)制備MIPs的過程中，NTCZB上的碳碳雙鍵容易與交聯(lián)劑發(fā)生共價鍵化學(xué)反應(yīng)而形成大分子結(jié)構(gòu)，使NTCZB沒有被洗脫完全，從而造成NTCZB的再吸附時印跡孔穴的浪費(fèi)和印跡位點利用率不高[9]。

綜上所述，MIPs 9樣品的分子印跡效果最好，在上述條件下對制備MIPs 9進(jìn)行紅外表征和吸附性能實驗研究。

表2 不同制備條件的MIPs的分子印跡效果Table 2 Imprinting effect of MIPs prepared under different conditions

2.3 MIPs 9對NTCZB印跡前后的紅外光譜分析

由圖5可知，3 條曲線的出峰位置很相近，但仍存在很多差異，洗脫前MIPs 9、洗脫后MIPs 9、NIPs 9在2 965 cm-1附近的雙峰是功能單體2-Vpy中吡啶環(huán)上的C—H伸縮振動峰，洗脫前MIPs 9在此處的峰形明顯區(qū)別于洗脫后MIPs 9和NIPs 9，這是因為LM上的?；c2-Vpy發(fā)生相互作用，形成氫鍵而締合于MIPs上，洗脫前MIPs 9在1 540 cm-1處和1 635 cm-1處比洗脫后MIPs 9和NIPs 9的強(qiáng)度弱，這主要是LM上的仲酰胺N—H和C=O反式存在的吸收峰產(chǎn)生[27]，洗脫前MIPs 9在2 853 cm-1處的峰是LM上的飽和C—H伸縮振動，洗脫前MIPs 9與洗脫后MIPs 9、NIPs 9的這些差異說明LM已經(jīng)通過氫鍵結(jié)合在了MIPs上[28]；洗脫后MIPs 9和NIPs 9幾乎沒有差別，這說明LM已經(jīng)完全被洗脫下來[29-30]。

圖5 MIPs 9和NIPs 9的紅外光譜圖Fig. 5 IR spectra of non-imprinted polymers and molecularly imprinted polymers

2.4 MIPs 9對花椒中NTCZB的分子印跡驗證實驗結(jié)果

圖6 花椒萃取液、甲醇洗脫液及NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig. 6 HPLC profiles of the extract of prickly ash, the methanol eluate and NTCZB standard

由圖6可知，甲醇洗脫液與NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品的峰形及出峰時間一致，可確證分離純化出的物質(zhì)主要成分是NTCZB；花椒萃取液中NTCZB的峰面積占總峰面積的（72.65±1.27）%，MIPs 9的甲醇洗脫液中NTCZB占總峰面積的（94.60±1.52）%，NTCZB占總峰面積的比例提高了約21.95%；同時，高效液相色譜檢測到濃縮的甲醇洗脫液中NTCZB質(zhì)量濃度為（34.2±3.1）μg/mL，經(jīng)計算MIPs 9對花椒的氯仿萃取液中NTCZB的吸附量為（14.64±0.80）mg/g。結(jié)果表明，MIPs 9對花椒萃取液中的NTCZB有較強(qiáng)的特異性吸附能力[31]。

3 結(jié) 論

取LM 0.25 mmol，以2-Vpy為功能單體，LM、功能單體、交聯(lián)劑物質(zhì)的量比為1∶4∶20，乙腈12 mL，AIBN 10 mg，在50 ℃恒溫水浴聚合4 h后再在60 ℃恒溫水浴聚合20 h，該條件下合成的MIPs對NTCZB具有較好的特異性吸附效果；在該條件下制備的MIPs可以吸附花椒萃取液中的NTCZB，吸附量達(dá)到（14.64±0.80）mg/g。實驗結(jié)果表明：分子印跡技術(shù)可以應(yīng)用于NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品的分離純化。采用LM能夠制備出對NTCZB具有較強(qiáng)印跡效果的MIPs。本研究為具有該分子結(jié)構(gòu)特點物質(zhì)的MIPs的制備提供了方法借鑒，同時也對NTCZB的研究和應(yīng)用具有借鑒價值。