王魯慧，肖軍霞，徐同成，王 鵬，黃國清,*

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）主要由清蛋白和球蛋白組成，蛋白質(zhì)含量在90%以上[1]，含有多種必需氨基酸及豐富的不飽和脂肪酸、鈣、磷、鐵、膳食纖維等[2]。

作為少數(shù)幾種可以與動(dòng)物性蛋白相提并論的植物源蛋白之一，SPI在食品工業(yè)中占有重要地位，但由于其溶解性、乳化性和起泡性等功能性質(zhì)較差，在一定程度上限制了應(yīng)用，因此對(duì)其進(jìn)行改性具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。改性是指利用生化和/或物理因素使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生某種變化，引起蛋白大分子空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)改變，從而獲得較好的功能特性和營養(yǎng)特性[3]。SPI的改性方法分為物理改性、化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性[4-7]。

糖基化能有效改善SPI的功能性質(zhì)，美拉德反應(yīng)是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化的一種重要途徑[8-9]。美拉德反應(yīng)由于安全性高、條件溫和及操作簡單等特點(diǎn)，在SPI的改性中具有很大的應(yīng)用潛力。例如，曾永昶等[10]通過對(duì)SPI的糖基化改性延長了其貯藏期；布冠好等[11]通過對(duì)SPI進(jìn)行糖基化改性降低了抗原性和致敏性；于莉萍等[12]研究用美拉德反應(yīng)提高SPI凝膠性的工藝條件，使得SPI的凝膠性顯著提高；Hernández-García等[13]表明與葡萄糖（glucose，Glu）的美拉德反應(yīng)可改善血漿蛋白和雞蛋清的乳化性能；Chen Xiumin[14]和Morales[15]等通過對(duì)SPI進(jìn)行糖基化改性提升了抗氧化性。在這些報(bào)導(dǎo)中多是有針對(duì)性的對(duì)某些性質(zhì)如溶解性、乳化性和抗氧化性等進(jìn)行研究，卻未對(duì)SPI美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行更加深入的表征。

本實(shí)驗(yàn)擬在濕熱條件下使SPI與Glu、麥芽糖（maltose，Mal）發(fā)生美拉德反應(yīng)，研究各條件對(duì)美拉德反應(yīng)程度的影響，并對(duì)所得產(chǎn)物的部分性質(zhì)進(jìn)行表征。旨在為美拉德反應(yīng)在SPI改性中的實(shí)際應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（食品級(jí)） 青島天新食品添加劑有限公司；Glu（分析純） 天津市鼎盛鑫化工有限公司；Mal（分析純） 上海市笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；金龍魚精煉大豆油（食品級(jí)） 盛達(dá)食品有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙酸、甲醇、95%乙醇溶液、磷酸、丙三醇（均為分析純）萊陽市康德化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍(lán)G250、雙丙烯酰胺（均為分析純），牛血清白蛋白（生化試劑） 天津市巴斯夫化工有限公司；丙烯酰胺（化學(xué)純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mr-90恒溫磁力攪拌器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；DL-5-B低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；T18高速分散儀 德國IKA公司；ZEN3690 Nano ZS90納米粒度及ζ電勢儀 英國馬爾文實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；MS104TS分析天平、Delta320 pH計(jì)、TGA 2-SF熱重分析儀 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司；UV-2000紫外分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司；F-2700熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；DYY-12電腦三恒多用電泳儀北京六一儀器廠；ST5凝膠成像儀 法國Vilber Lourmat公司；NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取8 g SPI，按質(zhì)量比4∶1加入2 g Glu或Mal，用190 mL蒸餾水溶解，使SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%。用NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值至9.0，分別置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴條件下反應(yīng)4 h后，冷卻至25 ℃，3 000 r/min離心15 min，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取8 g SPI，按質(zhì)量比4∶1加入2 g Glu或Mal，用190 mL蒸餾水溶解，使SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%。用NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值至9.0，置于80 ℃水浴條件下分別反應(yīng)2、4、6、8、10 h后，冷卻至25 ℃，3 000 r/min離心15 min，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.1.3 混合比例對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取4 g SPI，按質(zhì)量比4∶4、4∶2、4∶1.5、4∶1、4∶0.5分別加入Glu或Mal，用蒸餾水溶解，使SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%。用NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值至9.0，置于80 ℃水浴條件下反應(yīng)4 h后，冷卻至25 ℃，3 000 r/min離心15 min，測定美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度。

1.3.2 美拉德反應(yīng)程度的檢測

美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物在波長290 nm處具有特征性吸收，最終產(chǎn)物在波長420 nm處具有特征性吸收[14]，因此可用波長290 nm和420 nm處的吸光度表示美拉德反應(yīng)的程度。取離心后的上清液分別在上述2 個(gè)波長處測定吸光度，以蒸餾水作為對(duì)照。

1.3.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的表征

將天然SPI（SPI-N），加熱后的SPI（SPI-H），還原糖（Glu、Mal）與SPI的簡單混合物（SPI-Glu-Mix、SPIMal-Mix）以及它們?cè)趦?yōu)化條件下制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（SPI-Glu-MRPs、SPI-Mal-MRPs）放入-18 ℃條件下冷凍48 h，再將其放入真空冷凍干燥機(jī)中凍干，研磨成均勻的粉末待用。

1.3.3.1 溶解度測定

采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[16]。取6 支10 mL的帶塞試管，分別加入1 000 μg/mL的牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL后補(bǔ)足蒸餾水到1 mL，從而得到0～500 μg/mL的牛血清白蛋白稀釋溶液，取各質(zhì)量濃度的稀釋液0.1 mL分別加入5 mL 100 μg/mL的考馬斯亮藍(lán)G250溶液，旋渦振蕩混勻，靜置2 min，于波長595 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參照上述方法，測定溶液中可溶性蛋白的質(zhì)量濃度，溶解度用每毫升水溶液中溶解蛋白質(zhì)的微克數(shù)來表示[17]。分別取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物10 mL，3 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液稀釋10 倍，加入5 mL 100 μg/mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液，旋渦振蕩混勻，靜置2 min。以考馬斯亮藍(lán)G250溶液調(diào)零，于波長595 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SPI溶解度。

1.3.3.2 乳化活性測定

分別取一定體積一定質(zhì)量濃度的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，加入1/3體積的大豆色拉油，10 000 r/min高速攪拌5 min后，取1 mL乳化液加入79 mL蒸餾水稀釋，另取1 mL稀釋液與9 mL 1 g/L的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液混合均勻，以1 g/L的SDS為空白，于波長500 nm處測定吸光度。SPI的乳化活性按下式計(jì)算[18]：

式中：T為2.303；A為波長500 nm處乳化液的吸光度；N為稀釋倍數(shù)；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為乳化液中油相的體積分?jǐn)?shù)/%。

1.3.3.3 ζ電勢測定

取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的上清液1 mL，用去離子水按1∶10稀釋，渦旋振蕩，利用ZEN3690 Nano ZS90納米粒度及ζ電勢儀測定ζ電勢，測試溫度25 ℃，平行測定3 次。

1.3.3.4 溶液pH值的測定

分別將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在3 000 r/min離心15 min后，取上清液測定pH值。

1.3.3.5 熱穩(wěn)定性測定

取凍干后的樣品粉末0.003 0 g左右，分別加入熱重分析儀樣品盒中，以空白作為對(duì)照，氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，以10 ℃/min的速率從30 ℃加熱到500 ℃，記錄加熱過程中的熱曲線。

1.3.3.6 紅外光譜分析

取少量凍干后的樣品粉末于瑪瑙研缽中，加入一定量KBr進(jìn)行研磨，將研磨好的粉末壓片。將壓片置于紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描分析，空白KBr作為背景對(duì)照。

1.3.3.7 熒光光譜分析

取凍干后的樣品粉末，根據(jù)所測得的溶解度用pH 7.0、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至溶液中蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL，激發(fā)波長為334 nm，狹縫寬度5 nm，在波長350～500 nm進(jìn)行檢測。

1.3.3.8 SDS-PAGE分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測美拉德反應(yīng)對(duì)SPI組分的影響。

取凍干后的樣品粉末0.015 g，加入超純水，渦旋振蕩使其完全溶解，10 000 r/min離心10 min。取上清液200 μL加入染色劑染色，在沸水中煮沸5 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min。用進(jìn)樣針取10 μL依次加入到膠板的樣品道中，設(shè)置電壓200 V，電流50 mA。結(jié)束后將膠板取出，加入脫色液脫色至適宜顏色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每種樣品每次均測定3 個(gè)平行，結(jié)果以 ±s表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異顯著性分析采用方差分析（ANOVA）中的Tukey HSD測試，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）吸光度的影響Fig. 1 Effect of reaction temperature on the absorbance of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

由圖1A可知，隨著溫度的升高，SPI-Glu-MRPs的A290nm和A420nm都呈增加的趨勢，且A290nm和A420nm均在100 ℃時(shí)達(dá)到最大值，表明Glu與SPI發(fā)生了美拉德反應(yīng)。由圖1B可知，隨著溫度的升高，SPI-Mal-MRPs的A290nm和A420nm也基本呈增大趨勢，在100 ℃時(shí)A290nm達(dá)到最大，但A420nm在90 ℃時(shí)最大，100 ℃時(shí)顯著降低（P＜0.05），這可能是由于美拉德反應(yīng)程度過高，形成了大量不溶性的高級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物所致[19]。綜合比較，除100 ℃外，SPI-Glu-MRPs的A290nm和A420nm均高于SPI-Mal-MRPs，表明Glu比Mal更易于與SPI發(fā)生美拉德反應(yīng)。這可能是由于Glu的分子質(zhì)量要小于Mal，因此空間位阻更小，更易于與SPI中的反應(yīng)位點(diǎn)接觸[20-21]?？紤]到當(dāng)美拉德反應(yīng)程度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生不溶性的聚合物，本實(shí)驗(yàn)選擇80 ℃作為反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）吸光度的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the absorbance of SPI-Glu-MRPs (A)and SPI-Mal-MRPs (B)

由圖2A可知，SPI-Glu-MRPs的A290nm隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，并在6 h時(shí)達(dá)到最大；相應(yīng)SPI-Glu-MRPs的A420nm隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而緩慢升高，6 h后差異不顯著（P＞0.05），表明美拉德反應(yīng)逐漸進(jìn)入到高級(jí)階段，且在6 h時(shí)美拉德反應(yīng)程度較完全。由圖2B可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)SPI和Mal美拉德反應(yīng)的影響規(guī)律基本與Glu一致，即隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，A290nm先升高后降低，A420nm緩慢增加。綜合考慮美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度、反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性以及能耗問題，最終選取反應(yīng)時(shí)間6 h進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.3 混合比例對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

由圖3A可知，在SPI比例保持不變的情況下，隨著Glu比例的減少，SPI-Glu-MRPs的A290nm隨之顯著降低（P＜0.05），A420nm也基本呈現(xiàn)出了類似的趨勢。然而，混合質(zhì)量比對(duì)SPI與Mal美拉德反應(yīng)的影響要小很多。由圖3B可知，隨著反應(yīng)體系中Mal含量的減少，雖然A290nm也隨之降低，但是降低幅度遠(yuǎn)小于SPI-Glu-MRPs，這同樣可能是由于Glu和Mal分子結(jié)構(gòu)不同造成的。Glu分子更小，在溶液中的遷移速率更快，因此其比例的變化比SPI與Mal美拉德反應(yīng)的影響更大?？紤]到改性應(yīng)當(dāng)以SPI為主體，從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，選擇SPI與Glu/Mal混合質(zhì)量比4∶1繼續(xù)進(jìn)行研究。

圖3 混合質(zhì)量比對(duì)SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）吸光度的影響Fig. 3 Effect of mass ratio between SPI and sugar on the absorbance of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的表征

2.2.1 溶解性測定結(jié)果

圖4 與Glu和Mal的美拉德反應(yīng)對(duì)SPI溶解性的影響Fig. 4 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the solubility of SPI

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2 h和6 h時(shí)，SPI-Mal-MRPs和SPI-Glu-MRPs的溶解性均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加，且前者的溶解性要高于后者，但是均高于在相同條件下加熱的SPI-H；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長至10 h時(shí)，2 種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性均顯著降低（P＜0.05），其中SPI-Glu-MRPs的溶解性甚至低于SPI-H，這表明當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過長時(shí)形成了不溶于水的大分子聚合物，美拉德反應(yīng)進(jìn)入了高級(jí)階段，且Glu更易于與SPI形成此類產(chǎn)物。這與圖2中6 h后美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A290nm開始降低及A420nm開始升高的趨勢一致。因此，與Glu和Mal適度的美拉德反應(yīng)可以顯著提高SPI的溶解性，在與羧甲基纖維素鈉[22]和麥芽糊精[23]的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中也觀察到了相同的結(jié)果。

2.2.2 乳化活性測定結(jié)果

與多糖發(fā)生美拉德反應(yīng)是提升蛋白質(zhì)乳化活性的重要手段[24]，干熱法是最常用于提升SPI乳化活性的方法，已有文獻(xiàn)表明干熱條件下與羧甲基纖維素鈉[22]、麥芽糊精[23,25]和Glu[26]的美拉德反應(yīng)可以顯著提升SPI的乳化活性，但是關(guān)于濕熱條件下美拉德反應(yīng)對(duì)SPI相關(guān)功能性質(zhì)的影響還比較少見。

圖5 與Glu和Mal的美拉德反應(yīng)對(duì)SPI乳化性的影響Fig. 5 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the emulsifying activity of SPI

由圖5可知，相同條件下SPI-H的乳化活性最高，加入還原糖會(huì)降低SPI-H的乳化活性，這可能是SPI與大豆油形成的乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被加入的還原糖破壞所致[25]。濕熱條件下加熱6 h后，SPI-H及2 種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性均隨之降低，且SPI-Glu-MRPs的乳化活性略高于SPI-Mal-MRPs，但是仍低于SPI-H，這與上述干熱條件下得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物乳化活性的變化規(guī)律相反。表明濕熱法和干熱法對(duì)SPI功能性質(zhì)具有不同的影響。這可能是由于在干熱狀態(tài)下，美拉德反應(yīng)主要發(fā)生在SPI分子表面，而在濕熱狀態(tài)下，SPI、Glu和Mal均處于伸展?fàn)顟B(tài)，因此接觸更加充分，反應(yīng)更加充分，使得SPI的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，降低了其在油水兩相界面的吸附作用，使得SPI的乳化活性降低[27]；同時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶解性增加意味著疏水性氨基酸含量降低[28-29]，這進(jìn)一步影響了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在油水界面的吸附作用，導(dǎo)致SPI的乳化活性降低。

2.2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液的pH值測定結(jié)果

由圖6可知，與Glu和Mal發(fā)生美拉德反應(yīng)6 h使SPI溶液的pH值由8.9降低至7.2和7.6。研究表明，SPI中參與美拉德反應(yīng)的氨基酸主要是賴氨酸和精氨酸[23]，在濕熱條件下，這2 種堿性氨基酸更容易參與美拉德反應(yīng)；同時(shí)，美拉德反應(yīng)會(huì)生成酸性物質(zhì)，這導(dǎo)致了SPI溶液pH值的降低。

圖6 與Glu和Mal的美拉德反應(yīng)對(duì)SPI溶液pH值的影響Fig. 6 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the pH of SPI solution

2.2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ζ電勢測定結(jié)果

圖7 與Glu和Mal的美拉德反應(yīng)對(duì)SPI溶液ζ電勢的影響Fig. 7 Effect of Maillard reaction with glucose and maltose on the ζ potential of SPI solution

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，SPI-Glu-MRPs和SPI-Mal-MRPs溶液的電勢與SPI-H相比差異較小，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長至6 h時(shí)，2 種產(chǎn)物的ζ電勢迅速降低，這可能是由于SPI中大量—NH2參與了美拉德反應(yīng)，質(zhì)子化程度降低，導(dǎo)致美拉德反應(yīng)產(chǎn)物負(fù)電荷含量增加，由圖6可知，在反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液的pH值降低，這一溶液pH值與ζ電勢的關(guān)系同張夢雪等[30]的測定結(jié)果一致；但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長至10 h時(shí)，SPI-Glu-MRPs和SPIMal-MRPs溶液的ζ電勢又開始增加，且高于SPI-H，這與Li Weiwei等[31]在SPI水解物與Glu和Mal美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中得到的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，在一定反應(yīng)程度下Mal和Glu結(jié)合同樣可以改變SPI表面電荷的分布且美拉德反應(yīng)程度高會(huì)增強(qiáng)靜電屏蔽作用[32]；另外，在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，SPI-Glu-MRPs的ζ電勢均高于SPI-Mal-MRPs。由于SPI的電荷特性對(duì)其在微囊化、溶液中的穩(wěn)定性等性質(zhì)有重要影響[23]，因此可通過選擇合適的還原糖種類或反應(yīng)時(shí)間來獲得具有所需電荷特性的改性SPI。

2.2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性

如圖8所示，變化速率明顯分為3 個(gè)階段，分別為第1階段60～200 ℃、第2階段200～300 ℃、第3階段300～500 ℃。在60～200 ℃范圍內(nèi)，SPI-Glu-MRPs（圖8A）和SPI-Mal-MRPs（圖8B）的熱量損失與SPI-N和SPI-H相比均較小。該溫度范圍內(nèi)的熱量損失通常是由于水分蒸發(fā)所致，水分蒸發(fā)減少表明美拉德反應(yīng)可能導(dǎo)致了大分子質(zhì)量產(chǎn)物的形成，使其持水能力增強(qiáng)[4]；在200～300 ℃范圍內(nèi)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量損失率急劇增加，這表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了一些易于分解或易于揮發(fā)的物質(zhì)，這些物質(zhì)在該溫度范圍內(nèi)發(fā)生了分解或揮發(fā)，從而導(dǎo)致質(zhì)量急劇下降[24,33]；在300～500 ℃范圍內(nèi)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生分解。這說明美拉德反應(yīng)會(huì)適當(dāng)降低SPI的熱穩(wěn)定性。

圖8 SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）的熱重分析圖譜Fig. 8 DTG patterns of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

2.2.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜分析

圖9 SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）的紅外光譜圖Fig. 9 FTIR spectra of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

如圖9所示，3 441 cm-1處的吸收峰為—NH2＋的伸縮振動(dòng)峰，在SPI-Glu-MRPs（圖9A）和SPI-Mal-MRPs（圖9B）均出現(xiàn)了該峰，表明該基團(tuán)并未完全參與美拉德反應(yīng)；但是在SPI-Glu-MRPs中與SPI-H相比峰變寬，表明發(fā)生的美拉德反應(yīng)對(duì)該基團(tuán)產(chǎn)生了一定的影響；1 650 cm-1對(duì)應(yīng)乙酰胺基CH3—O＝C—NH—中的—CO—的伸縮振動(dòng)，與SPI-H相比，2 種反應(yīng)產(chǎn)物的峰也變寬，表明SPI與2 種糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

2.2.7 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度分析

圖10 SPI-Glu-MRPs（A）和SPI-Mal-MRPs（B）的熒光光譜圖Fig. 10 Fluorescence spectra of SPI-Glu-MRPs (A) and SPI-Mal-MRPs (B)

熒光強(qiáng)度可以作為美拉德反應(yīng)程度的一個(gè)指標(biāo)，當(dāng)美拉德反應(yīng)進(jìn)入到高級(jí)階段時(shí)即會(huì)形成熒光物質(zhì)[34]。由圖10可知，2 種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在400～425 nm波長處均具有特征吸收，且吸收均強(qiáng)于相應(yīng)的單體及簡單混合物，這與在酪蛋白和乳清蛋白同Mal或乳糖形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中觀察到的結(jié)果一致[35]，表明SPI與還原糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)；通過比較還可以看出，SPI-Glu-MRPs的熒光強(qiáng)度比SPI-Mal-MRPs強(qiáng)，表明Glu更易于與SPI發(fā)生美拉德反應(yīng)，這與圖1中觀察到的結(jié)果一致。

2.2.8 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖11 SPI-Glu-MRPs和SPI-Mal-MRPs的SDS-PAGE圖譜Fig. 11 SDS-PAGE patterns of SPI-Glu-MRPs and SPI-Mal-MRPs

由圖11可以看出，SPI-H比SPI-N條帶數(shù)少，具體表現(xiàn)為11S組分中對(duì)應(yīng)于蛋白分子質(zhì)量43 kDa的條帶、7S組分中對(duì)應(yīng)于22 kDa的條帶消失，推斷可能是加熱使得SPI變性和聚集所致；與SPI-Mal-Mix（條帶2）和SPI-Glu-Mix（條帶4）相比，SPI與Mal（條帶1）和Glu（條帶3）發(fā)生美拉德反應(yīng)后在高分子質(zhì)量處出現(xiàn)了明顯的條帶，11S組分有2 個(gè)條帶顏色變淺，同時(shí)與SPI-H相比66.2 kDa的條帶消失，這證實(shí)了SPI與Mal和Glu發(fā)生了美拉德反應(yīng)并形成了高分子聚合物。

3 結(jié) 論

分別對(duì)Glu、Mal與SPI的美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度越高，時(shí)間越長，美拉德反應(yīng)程度越高。綜合考慮能源消耗問題，確定美拉德反應(yīng)表征的研究條件為SPI與Glu/Mal混合質(zhì)量比4∶1、反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h。

美拉德反應(yīng)明顯改善了SPI的溶解度，并且Mal比Glu對(duì)SPI的改性效果更佳；美拉德反應(yīng)降低了SPI的乳化性，這與干熱條件下的大部分報(bào)導(dǎo)結(jié)論相反，表明干熱和濕熱條件下SPI與糖的美拉德反應(yīng)進(jìn)程可能有所不同；美拉德反應(yīng)對(duì)SPI的ζ電勢有一定影響，隨著美拉德反應(yīng)程度的增加，SPI的負(fù)電荷明顯減少；美拉德反應(yīng)會(huì)使SPI溶液的pH值降低；熱穩(wěn)定性分析表明美拉德反應(yīng)降低了SPI的熱穩(wěn)定性；傅里葉變換紅外光譜分析表明美拉德反應(yīng)在SPI中引入了新的化學(xué)鍵；熒光分析表明美拉德反應(yīng)增強(qiáng)了SPI的熒光強(qiáng)度；SDS-PAGE表明美拉德反應(yīng)導(dǎo)致了大分子的形成。

綜上所述，SPI與還原糖在濕熱條件下的美拉德反應(yīng)對(duì)SPI的溶解性有一定的改善作用，并可通過反應(yīng)程度來調(diào)節(jié)產(chǎn)物的ζ電勢。SPI作為食品工業(yè)中最為重要的植物性蛋白源，其改性產(chǎn)物在實(shí)際應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用前景。