朱彥祺，郭全友*，姜朝軍，李保國*

大黃魚（Pseudosciaena crocea）是我國地方性海水魚類，在我國漁業(yè)經濟中占據重要地位[1-2]。大黃魚多以鮮魚出口、內銷或制成輕腌大黃魚流通，生鮮制品已成為大黃魚產品最常用的運輸和消費途徑。據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織調查，捕獲的魚類大約有30%～50%在食品供應鏈的不同環(huán)節(jié)發(fā)生損失，主要是由于水產品的運輸、貯藏條件要求高，環(huán)境和溫度的波動對其貨架期影響大[3]。

影響大黃魚貨架期的主要因素是微生物的生長代謝作用[4-6]。在微生物的作用下，魚體中的蛋白質、氨基酸及其他含氮物質被分解，會產生氨、胺類、硫化物、醇類、醛類、酮類、有機酸和其他小分子產物，導致魚體腐敗變質。造成魚變質的主要微生物稱作優(yōu)勢腐敗菌[7]，腐敗菌的生長受到營養(yǎng)成分、水分活度、pH值、貯藏溫度、相對濕度、環(huán)境氣體等影響[8]。微生物的生長繁殖和自我修復都需要消耗營養(yǎng)來維持內部平衡，營養(yǎng)成分的缺失會導致細菌生長緩慢、失活、死亡[9]。碳源作為微生物生長的六大要素之一，對微生物的生長繁殖有很大影響，研究微生物對碳源的利用情況，分析其差異性對抑制微生物生長，延長貨架期具有指導作用。其中Biolog檢測系統(tǒng)可以研究微生物對營養(yǎng)成分碳源的利用程度，探索微生物群體水平的生理功能和代謝功能的多樣性，可作為控制腐敗微生物生長的有效方法，目前有郭全友等[10]對魚源莓實假單胞菌的碳源利用進行了分析，對淡腌青魚中木糖葡萄球菌的碳源代謝能力進行了研究[11]，但鮮見對同種特定產品中優(yōu)勢腐敗菌碳源利用差異性的分析。

最大比生長速率和延滯期是反映微生物生長動力學的主要參數，最大比生長速率反映微生物生長的快慢，延滯期表示細菌適應環(huán)境的能力，是描述微生物生長及貨架期預測的主要指標，通常使用Gompertz模型進行參數擬合運算，得到相應動力學參數，建立微生物生長模型。許鐘等[12]建立了冷藏羅非魚特定腐敗菌在0、5、10、15 ℃的生長動力學Gompertz模型，可實時預測0～15 ℃貯藏羅非魚的微生物量和剩余貨架期。焦維楨等[13]建立了真空包裝鱘魚在冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌的生長Gompertz預測模型，為延長貨架期提供參考依據。但微生物碳源利用過程生長動力學的研究甚少，對Biolog檢測結果使用Gompertz模型擬合，得到其動力學參數，可知該種碳源是否為其生長所需碳源及其利用程度，相關模型可為優(yōu)化產品配方、有效抑制細菌活動提供參考。

本研究以新鮮大黃魚作為研究對象，在常用運輸貯藏溫度5、25 ℃條件下確定其貨架期，分離優(yōu)勢腐敗菌，使用Biolog檢測系統(tǒng)檢測優(yōu)勢腐敗菌對碳源利用率，并運用Gompertz模型擬合確定其碳源利用代謝的動力學參數，反映細菌能夠利用的底物種類以及對于底物的利用代謝水平和生長情況，探索新鮮大黃魚不同溫度下優(yōu)勢腐敗菌對碳源利用、動力學的差異性，為調控大黃魚在生產貯藏運輸中抑菌因子、延長新鮮大黃魚的貨架期提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大黃魚（每條約（450±50）g） 上海東方國際水產中心；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、高氯酸（分析純）、甲醇（優(yōu)級純）、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸、硼酸 國藥集團化學試劑有限公司；BUG培養(yǎng)基、Protrol A接種液、GEN-3鑒定板 美國Biolog公司；叔丁基甲基醚（優(yōu)級純）德國Sigma公司；鹽酸溶液（0.01 mol/L） 深圳博林達有限公司。

1.2 儀器與設備

微生物鑒定儀 美國Biolog公司；MIDI微生物脂肪酸鑒定儀 美國安捷倫公司；PCR擴增儀（PCR System 9700） 美國ABI公司；GelDoc-It凝膠成像儀 美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 大黃魚貨架期的確定

依據GB/T 18108—2008《鮮海水魚》方法取樣，對產品進行感官檢測，參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定方法》進行菌落總數的測定，參照SC/T 3032—2007《水產品中揮發(fā)性鹽基氮的測定方法》進行揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量的測定。樣品分別于5 ℃每24 h進行檢測，于25 ℃每8 h檢測。參照SC/T 3101—2010《鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃魚》與GB 2733—2015《鮮、凍動物性水產品》，當菌落總數達到7（lg（CFU/g））或TVBN含量不小于30 mg/100 g時判斷該產品到達其貨架期。

1.3.2 優(yōu)勢腐敗菌的分離及鑒定

1.3.2.1 細菌的分離

在貯藏初始點和貨架期終點，在測定菌落總數的平板上根據菌落形態(tài)挑取菌株，依據菌落形態(tài)、革蘭氏染色、細胞形態(tài)、芽孢有無、運動性及氧化、發(fā)酵等特征，采用雙歧分類法進行分組，每組挑取所有菌落或若干菌落,分離純化，25 ℃培養(yǎng)48 h[14]。純化后進行鑒定，根據貯藏初始點和貨架期終點的菌相變化確定優(yōu)勢腐敗菌。

1.3.2.2 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

將腐敗菌株經過反復分離純化，接種到TSA培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)24 h。

采用MIDI脂肪酸初步鑒定：挑取分離所得菌在營養(yǎng)瓊脂上進行劃線，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取40 mg（濕質量）菌落，進行皂化、甲基化、萃取、洗滌等步驟，獲取含有細菌脂肪酸的萃取液；用氣相色譜儀結合氫火焰離子化檢測器及MIDI分析系統(tǒng)分析測試結果，分析其菌相變化，將貨架期終點占比最高的腐敗菌反復純化進行下一步鑒定。

分子鑒定方法：用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取純化菌株的DNA，正向引物為27F，反向為1492R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：正向27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

PCR擴增采用25.0 μL體系，反應條件為：2.5 μL 10×PCR buffer；2.5 μL dNTP（含Mg2＋）；0.3 μL Taq DNA酶；1.0 μL正向引物；1.0 μL反向引物；1.0 μL DNA模板；16.7 μL ddH2O。PCR步驟：94 ℃熱啟動5 min；94 ℃預變性5 min；進行25 個循環(huán)[15-16]；94 ℃變性1 min、57 ℃退火1 min、72 ℃復性2 min；72 ℃延伸10 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增產物，產物約為1 500 bp。將PCR產物送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.3.3 優(yōu)勢腐敗菌碳源利用分析

1.3.3.1 碳源利用的測定

將鑒定后的優(yōu)勢腐敗菌劃線分離純化。取單菌落在BUY培養(yǎng)基上劃線，25 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，接種到鑒定板配套的接種液Protrol A試劑中，使菌體均勻分散于接種液，濁度值達到（98±1）%時，將菌懸液加在96 孔鑒定板（GEN-3）內，每孔100 μL。25 ℃培養(yǎng)100 h，5 ℃培養(yǎng)145 h，待利用達到平穩(wěn)。每3 h測定OD值，碳源包括糖類31 種、氨基酸類10 種、己糖磷酸類8 種、羧酸類15 種、酯類3 種、其他4 種[17]。通過OD值可以反映微生物對碳源利用的種類、速率、延滯期，體現(xiàn)微生物的生長情況。

1.3.3.2 碳源利用動力學分析

每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）是衡量微生物利用不同碳源整體能力的指標之一[18-19]，顏色變化的深淺即代表該種碳源的利用強弱。AWCD的計算公式如式（1）所示：

式中：Ci為每個測試孔590 nm波長處的OD值；R為對照孔的OD值；n為底物數量（GEN-3板，n=71）。

參考郭全友等[20]針對環(huán)境因子對大黃魚腐敗希瓦氏菌生長影響的計數法分析研究，以及Verschuere等[21]對Biolog微孔板的數據進行建模；對4 種腐敗菌碳源利用的生長情況采用Gompertz方程進行擬合，計算其碳源利用的動力學參數，見式（2）：

式中：a為最小OD值；b為最大OD值與最小OD值之差；c為該碳源利用下的最大比生長速率[21]；d為延滯期；x為時間；y為OD值。

1.4 數據分析

系統(tǒng)發(fā)育樹分析：測序得到菌株16S rRNA序列（約1 500 bp），將測序結果登陸NCBI網站，通過BLAST程序與GenBank中的核酸序列進行比對，從中選出相似性最高的序列，應用Chromas version 1.62進行多重比較，利用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇HKY模型，Bootstrap重復為500 次。Biolog數據分析使用SPSS 21.0軟件以及Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 大黃魚的貨架期結果

如圖1所示，貯藏初始點時大黃魚中的菌落總數為（4.21±0.25）（lg（CFU/g）），TVBN含量為（8.04±1.07）mg/100 g，在5 ℃貯藏過程中隨時間延長，菌落總數和TVBN含量都呈逐步遞增趨勢，在50 h后上升的速率明顯增加，最終在216 h（9 d）為（7.70±0.15）（lg（CFU/g））和（29.98±2.19）mg/100 g，表明新鮮大黃魚在5 ℃時貯藏的貨架期為（9.0±1.0）d。在25 ℃貯藏過程中菌落總數和TVBN含量都隨時間延長而增加，在24 h時分別達到（7.21±0.24）（lg（CFU/g））和（28.03±0.38）mg/100 g，超出標準，表明大黃魚在25 ℃貯藏的貨架期為（1.0±0.11）d。

圖1 貯藏過程中大黃魚的品質變化Fig. 1 Change in microbial quality during storage of fresh P. crocea

許鐘等[22]研究了大黃魚在0、5、10 ℃冷藏條件下的貨架期，通過曲線擬合得到的貨架期分別為15、8.6 d和4.5 d；郭全友等[23]建立了0～25 ℃間新鮮大黃魚的貨架期模型，結果顯示25 ℃貯藏條件下大黃魚的貨架期為1.1 d，與本實驗5、25 ℃時的研究結果相接近，說明溫度對大黃魚產品的貨架期影響顯著。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌鑒定

圖2 新鮮大黃魚2 種貯藏條件貨架期終點的菌相變化Fig. 2 Changes in bacterial flora at the end of shelf life at two storage temperatures

經MIDI脂肪酸初步鑒定后，生鮮大黃魚貯藏初始點、5、25 ℃貨架期終點的菌相組成比例如圖2所示。由圖2可知，貯藏初期大黃魚中有不動桿菌（Acinetobacter）24.44%、氣單胞菌（Aeromonas）11.13%、假單胞菌（Pseudomonas）20.0%、希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）6.66%、腸桿菌（Enterobacter）6.66%、弧菌屬（Vibrio spp.）3.1%、莫氏菌屬（Mohs spp.）17.8%、未知菌屬10.33%；5 ℃貨架期終點時，希瓦氏菌比例從6.66%增加到65.12%，25 ℃貨架期終點時，弧菌相對含量從3.1%增加到48.48%。初始階段2 種菌的相對含量并不高，在貨架期終點達到最大比例。腐敗希瓦氏菌是冷藏大黃魚中典型的腐敗菌，適宜在低溫環(huán)境中生長[24]，相對不動桿菌屬和氣單胞菌屬在低溫貯藏環(huán)境有更短代時，生長速度快；弧菌能吸附于魚體黏液，在室溫條件下更易于繁殖，在貯藏過程中的優(yōu)勢菌具有更短的代時，生長速度快，底物利用率高或者可以通過某種方式抑制其他菌屬的生長[23]。其他細菌由于溫度降低、營養(yǎng)缺乏使生長速率減緩，代時增長使細胞失活逐漸消亡，腐敗希瓦氏菌和河流弧菌的生長繁殖逐漸占據主導地位，通過生長代謝分解魚體蛋白質、氨基酸及其他含氮物質，產生氨、胺類、硫化物、醇類、醛類、酮類、有機酸和其他小分子產物，導致魚體腐敗變質。

圖3 2 種特定腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic trees for the dominant spoilage bacteria

對希瓦氏菌屬及弧菌屬的腐敗菌進行進一步分子鑒定，通過BLAST比對和系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖3），S1和腐敗希瓦氏菌的相似度達到100%，S2與河流弧菌的相似度達到100%，說明在5、25 ℃條件下，新鮮大黃魚的優(yōu)勢腐敗菌分別為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens KX822698）與河流弧菌（Vibrio fluvialis KX817289）。

李學英等[25]研究表明大黃魚低溫貯藏貨架期終點時的優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，其次為假單胞菌；郭全友等[26]研究認為大黃魚在室溫下特定腐敗菌為弧菌和腸桿菌，出現(xiàn)腸桿菌可能與水產品生長的水質和環(huán)境有關；Zhu Junli等[8]研究得出貯藏初期新鮮大黃魚中腐敗希瓦氏菌占29%，弧菌屬占22.6%，經過5 d、4 ℃貯藏，腐敗希瓦氏菌比例可上升到72.1%，弧菌屬比例下降到7%；另外，朱蘇琴等[27]的研究證實河流弧菌能很好地黏附于大黃魚的黏液，室溫下黏液中的河流弧菌很容易加速大黃魚的腐敗變質，也與本研究分離得出的新鮮大黃魚中優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌與河流弧菌結果相一致。

2.3 腐敗菌碳源利用的差異性

2.3.1 腐敗菌對總體碳源的利用

圖4 2 種腐敗菌在不同溫度下總體碳源利用情況Fig. 4 Overall carbon source utilization by the spoilage bacteria at different temperatures

由圖4可知，5 ℃條件下2 種腐敗菌的總體能源利用率低于25 ℃，5 ℃腐敗希瓦氏菌AWCD是25 ℃時的2/3，5 ℃河流弧菌的AWCD是25 ℃時的1/7；5 ℃時腐敗希瓦氏菌的AWCD大于河流弧菌，在5 ℃時河流弧菌的AWCD僅為0.13，利用能源的能力減弱，生長受到抑制；25 ℃時河流弧菌的AWCD是腐敗希瓦氏菌的2.3 倍，生長繁殖快。

表1 2 種腐敗菌的動力學參數及其擬合優(yōu)度Table 1 Kinetic parameters and goodness of fit for the spoilage bacteria

通過Gompertz方程計算得出能源利用的動力學參數。由表1可知，2 種腐敗菌在5 ℃碳源條件下的最大比生長速率均小于25 ℃，延滯期均大于25 ℃時。在5 ℃時腐敗希瓦氏菌較早進入指數期增長，最大比生長速率是河流弧菌的4 倍；25 ℃時，腐敗希瓦氏菌的最大比生長速率較大，為（0.074±0.014）h-1，河流弧菌為（0.029±0.002）h-1。證明了在25 ℃條件下，腐敗菌最大比生長速率逐漸增加，延滯期縮短，促進了腐敗菌的生長，從而加速了大黃魚的腐敗。在5 ℃時腐敗希瓦氏菌能更好地利用碳源，25 ℃時河流弧菌能更好地利用碳源，碳源利用的結果與5、25 ℃分離出的優(yōu)勢腐敗菌結果相符，說明溫度是影響碳源利用的因素，碳源利用率受限，生長繁殖也受到抑制。

2.3.2 腐敗菌碳源利用的種類分析

圖5 腐敗菌在不同溫度下總體能源利用種類Fig. 5 Carbon source utilization profiles of the spoilage bacteria at 5 and 25 ℃

由圖5可知，在5 ℃與25 ℃時，河流弧菌都能較好地利用單糖、多糖、羧酸和氨基酸，其對單糖（27.50%、27.78%）、多糖（26.32%、24.45%）的利用率相對穩(wěn)定，25 ℃時對氨基酸的利用率下降到16.13%，對羧酸的利用率上升到14.02%，碳源利用種類沒有發(fā)生改變；腐敗希瓦氏菌在5 ℃條件下主要利用單糖（17.22%）、多糖（22.57%）、羧酸（33.53%）和酯類（15.67%），在25 ℃時，利用的碳源為單醣、多糖、羧酸和氨基酸，其中氨基酸的利用率相較5 ℃的4.22%上升到18.09%，酯類的利用率明顯減少到4.19%。2 種腐敗菌各類碳源在相同溫度下利用率差異顯著（P＜0.05）。

圖6 腐敗菌在不同溫度下各類碳源的利用曲線Fig. 6 Carbon source utilization curves at different temperatures

由圖6可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在各碳源條件下的最大比生長速率從大到小為多糖（0.31 h-1）、酯類（0.19 h-1）、羧酸（0.16 h-1）、單糖（0.12 h-1）和氨基酸（0.079 h-1）；河流弧菌各種碳源條件下的最大比生長速率從大到小為多糖（0.027 h-1）、單糖（0.024 h-1）、氨基酸（0.022 h-1）和羧酸（0.019 h-1）；腐敗希瓦氏菌各類碳源下的最大比生長速率均高于河流弧菌，說明河流弧菌的各類碳源利用在5 ℃受到抑制。25 ℃時腐敗希瓦氏菌在單糖、多糖、氨基酸和羧酸下的最大比生長速率均大于河流弧菌，其中在羧酸下的最大比生長速率最大（1.24 h-1），腐敗希瓦氏菌利用碳源的速率大于河流弧菌，但對各類能源的利用量少于河流弧菌。

郭全友等[11]對輕腌青魚貨架期終點葡萄球菌的碳源利用情況進行了研究，結果顯示該種腐敗菌主要利用單糖、多糖、氨基酸及羧酸，與本研究中河流弧菌利用的碳源種類相似，與腐敗希瓦氏菌的主要利用能源不同，表明不同腐敗菌的碳源利用種類存在差異，同種腐敗菌不同溫度下的利用種類、比生長速率、延滯期都存在差異。

2.3.3 腐敗菌對各類碳源利用的差異性

2.3.3.1 多糖利用

圖7 腐敗菌在不同溫度下對多糖利用的曲線Fig. 7 Polysaccharide utilization curves of the dominant spoilage bacteria at different temperatures

從圖7可知，在5 ℃條件下，2 種腐敗菌都能利用肌苷和D-海藻糖；其中，腐敗希瓦氏菌能利用蔗糖、糊精和D-乳糖，河流弧菌還能利用D-麥芽糖、水蘇糖、蜜二糖和蜜三糖。在25 ℃條件下，2 種腐敗菌都能利用蔗糖、D-海藻糖、D-麥芽糖；其中，腐敗希瓦氏菌還能利用D-乳糖、水蘇糖和肌醇；河流弧菌還能利用糊精、D-松二糖。D-海藻糖是2 種腐敗菌都能利用的多糖，有研究表明[28]海藻糖能夠提高酵母菌的抗凍性，高濃度的海藻糖能夠使酵母菌在低溫時仍然保持活性，同樣低溫時D-海藻糖也可以給腐敗菌提供部分能量。

通過Gompertz模型擬合圖7曲線，得到的動力學參數比較顯示，5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在糊精中的最大比生長速率最大（（0.087±0.016）h-1）且利用量最大，在肌苷中的延滯期最短（（13.778±0.649）h）；河流弧菌在蔗糖中的最大比生長速率最大（（0.024±0.010）h-1）且延滯期最短（（20.8±1.85）h）。說明糊精和蔗糖分別為2 種腐敗菌在5 ℃條件下最容易利用的多糖。在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在肌醇中的最大比生長速率最大（（0.1698±0.031）h-1），且利用量最大，對蔗糖利用延滯期最短（（3.63±0.61）h）；河流弧菌在水蘇糖中的最大比生長速率最大（（0.059±0.006）h-1），在D-麥芽糖中的延滯期最短（（0.024±0.001）h）。說明肌醇和水蘇糖是2 種腐敗菌在25 ℃條件下最容易利用的多糖。同種腐敗菌不同溫度下對多糖利用的種類大致相同，室溫時能利用的種類更多，最大比生長速率更大；不同腐敗菌相同溫度下能利用的多糖種類有所不同，2 種溫度條件下腐敗希瓦氏菌多糖利用的速率均大于河流弧菌。

2.3.3.2 單糖利用

圖8 腐敗菌在不同溫度下對單糖利用生長曲線Fig. 8 Monosaccharide utilization curves of the dominant spoilage bacteria at different temperatures

由圖8可知，在5、25 ℃條件條件下，腐敗希瓦氏菌都能利用D-阿拉伯醇、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-果糖；5 ℃條件下還能利用α-D-葡萄糖。

在5 ℃條件下，河流弧菌能利用的單糖有：N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-果糖，在25 ℃條件下，還能利用D-水楊苷、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-甘露醇。2 種腐敗菌能共同利用的多糖為D-果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺。

擬合得到圖8曲線，動力學參數比較顯示，在5 ℃條件下,腐敗希瓦氏菌在D-水楊苷中的最大比生長速率最大（（0.37±0.000 3）h-1），在N-乙酰-β-D-甘露糖胺中的延滯期最短（（17.319±3.141）h）；河流弧菌在N-乙酰-D-葡糖胺中的最大比生長速率最大（（0.010 4±0.001 1）h-1）且延滯期最短（（22.538±4.03）h）。說明腐敗希瓦氏菌生長初期受N-乙酰-β-D-甘露糖胺作用，生長過程中D-水楊苷更容易被利用，而N-乙酰-D-葡糖胺則是河流弧菌生長繁殖中最容易利用的單糖。

在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在D-阿拉伯醇中的最大比生長速率最大（（0.180±0.063）h-1），在D-果糖中的延滯期最?。ǎ?.98±0.892）h）；河流弧菌在N-乙酰-D-葡糖胺中的最大比生長速率最大（（0.064±0.005）h-1）且延滯期最短（（5.46±1.13）h）。說明腐敗希瓦氏菌生長初期最先利用D-果糖，生長過程中D-阿拉伯醇更易被利用。

腐敗希瓦氏菌在5 ℃條件下單糖利用的種類與25 ℃大致相同，但利用效率較25 ℃低；河流弧菌在5 ℃條件下單糖的利用種類少于25 ℃，5 ℃時能利用的單糖在25 ℃時的利用效率占前幾位。腐敗希瓦氏菌在2 種溫度條件下利用速率最大、延滯期最短的單糖均不相同。

2.3.3.3 腐敗菌對氨基酸的利用

圖9 腐敗菌在不同溫度下對氨基酸利用生長曲線Fig. 9 Amino acid utilization curves of the spoilage bacteria at different temperatures

圖10 腐敗菌在不同溫度下對羧酸利用生長曲線Fig. 10 Carboxylic acid utilization curves of the spoilage bacteria at different temperatures

由圖9可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能夠利用L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-焦谷氨酸；在25 ℃條件下，還能利用D-絲氨酸、L-脯氨酸；在低溫環(huán)境中，腐敗希瓦氏菌氨基酸的利用效率比25 ℃時顯著下降。在5 ℃條件下，河流弧菌能利用的氨基酸為L-脯氨酸、D-絲氨酸和L-組胺；在25 ℃條件下，還能利用L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸。

擬合得到圖9曲線，動力學參數比較顯示，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-絲氨酸中最大比生長速率最大（（0.013 6±0.005 0）h-1），在L-焦谷氨酸中延滯期最短（（20.96±1.601）h）；河流弧菌在L-脯氨酸中的最大比生長速率最大（（0.004 6±0.001）h-1），且延滯期最短（（25.20±2.14）h）。說明腐敗希瓦氏菌生長初期先利用L-焦谷氨酸，L-絲氨酸在生長過程中更容易被利用。L-脯氨酸為5 ℃條件下河流弧菌最容易利用的氨基酸。

在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-脯氨酸中最大比生長速率最大（（0.117 2±0.064）h-1），在L-焦谷氨酸中延滯期最短（（0.67±0.006）h）；河流弧菌在D-絲氨酸中最大比生長速率最大（（0.049±0.005）h-1），在L-谷氨酸中延滯期最短（（5.39±2.03）h）。2 種溫度下，腐敗希瓦氏菌對L-焦谷氨酸的延滯期均最短，說明L-焦谷氨酸在腐敗希瓦氏菌生長繁殖初期為主要氨基酸供給。

2 種腐敗菌都能利用絲氨酸，研究顯示絲氨酸在使細菌適應厭氧環(huán)境時起重要作用[29]。據研究表明[30]養(yǎng)殖大黃魚肌肉中的氨基酸含量較多的為谷氨酸（9.67 mg/100 mg）、天冬氨酸（5.68 mg/100 mg）、賴氨酸（4.76 mg/100 mg），由此可知并非氨基酸含量越高，腐敗菌就利用的越多，腐敗菌對于氨基酸的利用，還受到其自身性質的影響。

2.3.3.4 腐敗菌對羧酸的利用

由圖10可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能夠利用L-蘋果酸、D-蘋果酸、溴-丁二酸和乙酰乙酸；在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能夠利用L-蘋果酸、D-蘋果酸、溴-丁二酸、乙酰乙酸和乙酸。在5 ℃條件下，河流弧菌能夠利用L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸和甲酸；在25 ℃條件下，河流弧菌能夠利用L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸。在2 種溫度條件下，2 種腐敗菌都能利用的羧酸為L-蘋果酸。

通過Gompertz模型擬合圖10曲線，得到的動力學參數比較顯示，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-蘋果酸中最大比生長速率最大（（0.090±0.006）h-1），在乙酸中延滯期最短（（18.10±1.360）h）；河流弧菌在甲酸中最大比生長速率最大（（0.012±0.001）h-1），在L-乳酸中延滯期最短（（13.23±3.31）h）。說明在5 ℃時腐敗希瓦氏菌的生長初期先利用乙酸，之后L-蘋果酸最容易被利用；河流弧菌的生長先利用L-乳酸，在生長過程中甲酸更容易被利用。

在25 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌在L-蘋果酸中的最大比生長速率最大（（0.140±0.02）h-1）且延滯期最短（（3.801±0.735）h）；河流弧菌在檸檬酸中的最大比生長速率最大（（0.073±0.006）h-1），且延滯期最短（（7.42±0.78）h）。說明25 ℃時L-蘋果酸和檸檬酸分別為2 種腐敗菌最容易利用的羧酸。

2.3.3.5 腐敗菌對酯類的利用

圖11 腐敗菌在不同溫度下對酯類利用生長曲線Fig. 11 Ester utilization curves of the spoilage bacteria at different temperatures

由圖11可知，在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能較好地利用丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯和吐溫40，最大比生長速率分別為（0.088±0.001 2）、（0.089±0.002 3）h-1和（0.043±0.002 2）h-1，說明D-乳酸甲酯為腐敗希瓦氏菌生長過程中最容易被利用的酯類。而河流弧菌對酯類的利用很低，酯類并非河流弧菌生長主要利用的碳源。曾有學者[31-32]利用月桂酸單甘油酯微乳液制成復合保鮮劑；利用油酸乙酯、吐溫80、戊醇制備O/W型微乳液抑制腐敗菌的生長。為此，可通過腐敗菌對酯類的利用情況，為進一步研究O/W型復合保鮮劑提供了科學依據。

3 結 論

本實驗研究了新鮮大黃魚在不同溫度下，其優(yōu)勢腐敗菌對碳源利用、動力學的差異性，得到結論為：溫度影響了大黃魚的貨架期，5 ℃時貨架期為（9.0±1.0）d，25 ℃時貨架期為（1.0±0.11）d。

5 ℃貨架期終點時的優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，25 ℃時貨架期終點的優(yōu)勢腐敗菌為河流弧菌。

腐敗希瓦氏菌在5 ℃時能更好地利用碳源，河流弧菌在25 ℃時能更好地利用碳源，碳源利用的結果與5、25 ℃分離出的優(yōu)勢腐敗菌結果相符。低溫使碳源利用率受限，生長繁殖受到抑制。

5 ℃時腐敗希瓦氏菌主要利用的碳源種類為單醣、多糖、羧酸和酯類，河流弧菌為單醣、多糖、羧酸和氨基酸。25 ℃時腐敗希瓦氏菌和河流弧菌都主要利用單糖、多糖、羧酸和氨基酸。5 ℃條件下糊精和蔗糖分別為腐敗希瓦氏菌和河流弧菌最容易利用的多糖；25 ℃時肌醇和水蘇糖是腐敗希瓦氏菌和河流弧菌最容易利用的多糖。2 種腐敗菌能夠共同利用的單糖為D-果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺。5 ℃時腐敗希瓦氏菌對氨基酸的利用率明顯下降，25 ℃時2 種腐敗菌能夠共同利用的氨基酸為L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和D-絲氨酸。5、25 ℃時2 種腐敗菌能共同利用的羧酸種類較少，為L-蘋果酸。在5 ℃條件下，腐敗希瓦氏菌能較好地利用丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯和吐溫40。

本研究通過2 種溫度環(huán)境條件下，腐敗希瓦氏菌、河流弧菌對碳源利用的差異性分析，研究了2 種腐敗菌的生長、底物利用及其動力學模型，以期在今后可以通過調節(jié)共同利用的底物碳源因子，或通過研制復合保鮮劑抑制腐敗菌的生長，適當延長大黃魚產品的貨架期。