陳蒙蒙 董 宣 邱 亮 萬(wàn)曉媛 謝國(guó)駟 黃 倢

?

凡納濱對(duì)蝦感染致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(AHPND)的定量分析*

陳蒙蒙1,2董 宣1邱 亮1,2萬(wàn)曉媛1謝國(guó)駟1黃 倢1,2①

(1. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing,AHPND)攜帶的pVA1-like質(zhì)粒所表達(dá)的PirAVp和PirBVp毒力蛋白對(duì)對(duì)蝦肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×105CFU/mlAHPND分離株20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦()進(jìn)行浸泡感染，于感染后2~9 d采集對(duì)蝦的肝胰腺、鰓、腸道、肌肉組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)各組織中的pirA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，感染后凡納濱對(duì)蝦各組織均能檢測(cè)到pirA，其中，肝胰腺在感染后第4天達(dá)到峰值, 為8.71×104copies/mg，而鰓、肌肉、腸道分別在第3、4、5天達(dá)到峰值，分別為9.08×103、2.59×104、5.76×104copies/mg。早期感染鰓組織中先出現(xiàn)AHPND的富集，在高死亡發(fā)生期，AHPND數(shù)量在肝胰腺和腸道出現(xiàn)高峰，在死亡數(shù)量逐漸下降的后期，各組織的AHPND均快速下降，腸道、肝胰腺和肌肉中的AHPND水平趨于接近。對(duì)蝦肝胰腺組織病理切片顯示，同一時(shí)間有臨床癥狀的病蝦和瀕死對(duì)蝦相比，瀕死對(duì)蝦表現(xiàn)出更嚴(yán)重的AHPND病理特征，且二者的組織病理特征均隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)變得更為嚴(yán)重，但檢測(cè)到的AHPND數(shù)量呈下降趨勢(shì)。研究表明，在AHPND感染過(guò)程中，組織中的pirA基因數(shù)量不能代表對(duì)蝦的發(fā)病程度，發(fā)病程度及組織病理嚴(yán)重的AHPND樣品中AHPND的數(shù)量不一定處于高水平狀態(tài)。

致急性肝胰腺壞死??；副溶血弧菌；浸浴感染；凡納濱對(duì)蝦；qPCR；時(shí)間進(jìn)程

2010年6月我國(guó)南方突發(fā)凡納濱對(duì)蝦()大量死亡的情況，在放苗后7~31 d出現(xiàn)肝胰腺萎縮、發(fā)黃，死亡率達(dá)90% (張寶存等, 2012)，同時(shí)，越南也出現(xiàn)了類似病害(Tran, 2013)，在2010~ 2014年期間，該病擴(kuò)散到了東南亞的馬來(lái)西亞、泰國(guó)以及美洲的墨西哥(Nunan, 2014; Sotorodriguez, 2014; Joshi, 2014)。該疫病早先被稱為早期死亡綜合征(Early mortality syndrome, EMS)，對(duì)蝦發(fā)病后的典型癥狀主要包括肝胰腺顏色變淺、萎縮、空腸空胃、甲殼變軟、失去活力等(FAO, 2013; Han, 2015a; la Pe?a, 2015)，對(duì)感染地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Flegel, 2012; Lightner, 2012)。張寶存等(2012)最早報(bào)道從發(fā)病對(duì)蝦中分離到 1株高毒力及耐藥的副溶血弧菌()，Tran等(2013)研究表明，導(dǎo)致該病的病原是副溶血弧菌，因病原和病理的明確，該病被重新命名為急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) (FAO, 2013)，導(dǎo)致AHPND的副溶血弧菌（AHPND-causing,AHPND）攜帶含毒力基因pirA和pirB的pVA1-like質(zhì)粒(Han, 2015b; Lee, 2015; Yang, 2013)，該質(zhì)粒大小為70 kbp，可表達(dá)毒力蛋白PirABVp(PirAVp和PirBVp)，該蛋白是AHPND的致病因子(Lee, 2015)。

目前，多數(shù)國(guó)內(nèi)外研究者普遍采用Tran等(2013)建立的人工感染方法，使用高濃度（108CFU/ml）的AHPND浸泡幼蝦15 min，然后持續(xù)在含低濃度（106CFU/ml）的AHPND水體中養(yǎng)殖和觀察，成功感染的對(duì)蝦可能在24~72 h內(nèi)接近100%的死亡，并出現(xiàn)典型的AHPND癥狀，包括肝胰腺色淺、空腸空胃等，病理變化主要表現(xiàn)為肝胰腺小管上皮細(xì)胞變薄、脫落。在養(yǎng)殖過(guò)程中，水體中的病原達(dá)到如此高的濃度實(shí)現(xiàn)直接感染比較困難，絕大多數(shù)情況為中低濃度的感染，感染過(guò)程中，對(duì)蝦的臨床癥狀逐漸發(fā)生變化。基于這樣的研究背景，本研究圍繞凡納濱對(duì)蝦AHPND病原感染-病理變化-臨床表征的相關(guān)性這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，通過(guò)對(duì)健康凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行低濃度的浸泡感染實(shí)驗(yàn)，采取組織病理學(xué)和熒光定量PCR等技術(shù)手段確定被感染凡納濱對(duì)蝦臨床表征、病理變化與AHPND在體內(nèi)的組織分布與載量的相關(guān)性，為AHPND的診斷、防控和生物安保體系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

副溶血弧菌菌株20130629002S01為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)研究室保存菌株，于2013年6月分離自廣西北海發(fā)病凡納濱對(duì)蝦幼蝦，經(jīng)鑒定帶有毒力基因pirA和pirB，確定為致AHPND副溶血弧菌(AHPND)，且完成了全基因組序列測(cè)定。

1.2 對(duì)蝦

體重為1 g左右的健康凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自山東東營(yíng)對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖場(chǎng)，將對(duì)蝦分裝到50 L水族箱中，保持水溫恒定為(27±2)℃，每天投喂飼料1次，換水1次，每次換水量約為20%，在進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)前于本實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)約7 d。

1.3 病原檢測(cè)

隨機(jī)采集128尾對(duì)蝦，參照OIE (2017)水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)及已發(fā)表文獻(xiàn)中的PCR方法進(jìn)行病原檢測(cè)，包括白斑綜合征病毒(WSSV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、傳染性肌壞死病毒(IMNV)、桃拉綜合征病毒(TSV)、偷死病野田村病毒(CMNV) (Zhang, 2014)、蝦肝腸胞蟲(EHP) (Tang, 2015)和致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(AHPND) (Sirikharin, 2014)。

1.4 qPCR質(zhì)粒構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為135 bp的pirA基因片段（表1），連接到pGEM-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pVpPirA-1 (Han, 2015b)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌()后擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，Nanodrop 2000準(zhǔn)確測(cè)定濃度，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行熒光定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 菌株20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒力檢測(cè)

取150尾凡納濱對(duì)蝦，隨機(jī)分成5組，1~4組為實(shí)驗(yàn)組，5組為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，早晚各投喂1次，每天換水1次。將菌株20130629002S01接種于含2% NaCl的TSB（TSB+）液體培養(yǎng)基中，搖床155 r/min、28℃培養(yǎng)12 h，8000 r/min離心5 min，收集沉淀，用滅菌海水重懸，測(cè)定濃度為109CFU/ml。將細(xì)菌懸液加到水體中，使其濃度依次為108、107、106和105CFU/ml，每天換水后補(bǔ)加菌液，整個(gè)感染實(shí)驗(yàn)中維持水體中菌的濃度不變；對(duì)照組添加等量海水。實(shí)驗(yàn)觀察6 d，每日定時(shí)投喂并換水，記錄死亡對(duì)蝦尾數(shù)，計(jì)算20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦的半致死量(LD50)，用無(wú)菌牙簽沾取肝胰腺部位接種到滅菌2216E培養(yǎng)基中，進(jìn)行AHPND菌株20130629002S01重新分離鑒定。

1.6 人工感染實(shí)驗(yàn)

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行20尾凡納濱對(duì)蝦，置于50 L水族箱中，保持水溫恒定為(27±2)℃，早晚各投喂1次。實(shí)驗(yàn)組采用菌液浸泡感染，根據(jù)AHPND菌株20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒力檢測(cè)結(jié)果，水體中加入的菌液濃度約為2.19×105CFU/ml，每天換水后補(bǔ)加菌液，整個(gè)感染實(shí)驗(yàn)中維持水體中菌的濃度不變；對(duì)照組添加等量海水。

表1AHPNDpirA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法的引物和探針序列

Tab.1 The primers and probe sequence of the qPCR method forpirAVp gene of VpAHPND

1.7 組織病理學(xué)觀察

人工感染后，對(duì)照組隨機(jī)選取凡納濱對(duì)蝦實(shí)驗(yàn)組分別于24、48、72 h選取出現(xiàn)肝胰腺發(fā)白、萎縮，疑似感染AHPND對(duì)蝦和已失去活力的瀕死對(duì)蝦，將對(duì)蝦肝胰腺?gòu)念^胸甲中線切開，一半采用Davidson’s AFA固定液固定(Bell, 1988)，另一半肝胰腺提取DNA用于qPCR檢測(cè)；Davidson’s AFA固定液固定的頭胸甲組織，經(jīng)過(guò)梯度脫水、透蠟、切片后進(jìn)行HE染色，中性樹脂封片后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.8 樣本采集和qPCR檢測(cè)

浸泡感染2~9 d，對(duì)照組每天隨機(jī)選取對(duì)蝦、實(shí)驗(yàn)組每天對(duì)瀕死凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、鰓、中后腸道、尾節(jié)肌肉進(jìn)行取樣，每個(gè)組分別采3尾，每個(gè)平行1尾，將組織樣品裝入1.5 ml空無(wú)菌離心管并稱重。依據(jù)海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司, 北京)說(shuō)明書進(jìn)行對(duì)蝦樣品DNA的提取，加入50 μl無(wú)RNase水溶解，并用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其準(zhǔn)確濃度和純度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)各組織中AHPND數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)蝦的檢測(cè)

對(duì)隨機(jī)取樣的128尾實(shí)驗(yàn)用蝦，采用OIE(2017)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法對(duì)其進(jìn)行病原檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，WSSV、YHV、IHHNV、IMNV、TSV、CMNV、EHP和AHPND均為陰性。

2.2 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取重組質(zhì)粒pVpPirA-1，調(diào)整其濃度為1.0× 109copies/μl DNA，對(duì)已知濃度的pVpPirA-1進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋的梯度溶液為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，確定其標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度為10copies/μl DNA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的2=0.993，回歸方程為：

=–3.235′Lg()+ 37.555

式中，為拷貝數(shù)，為循環(huán)數(shù)。與Han等(2015b)的結(jié)果一致。

2.3 VpAHPND菌株20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒力檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組1~4組分別用濃度為108、107、106和105CFU/ml的菌株20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì) 蝦進(jìn)行浸泡感染，記錄實(shí)驗(yàn)組6 d內(nèi)對(duì)蝦死亡情況（表2），由Reed-Muench法（Brown, 1964）計(jì)算出20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦的LD50為6.52× 105CFU/ml；凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中的細(xì)菌通過(guò)重新分離、鑒定，確定可分離出帶有毒力基因pirA可致AHPND的AHPND。

表2 不同濃度AHPND菌株20130629002S01浸泡感染凡納濱對(duì)蝦死亡率

Tab.2 Mortality of L. vannamei challenged with different dose of VpAHPND strain 20130629002S01 by immersion

2.4 感染實(shí)驗(yàn)中對(duì)蝦死亡率

用2.19×105CFU/ml (即0.34 LD50)的菌株20130629002S01浸泡感染凡納濱對(duì)蝦，整個(gè)感染實(shí)驗(yàn)為11 d。實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組蝦肝胰腺正常，切面深棕色，腹節(jié)肌肉透明，對(duì)蝦正常攝食，胃腸道充滿食物（圖1a和圖1b）。實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦在感染第2天開始出現(xiàn)蝦體顏色變淺、肝胰腺外觀顏色變淺甚至發(fā)白、萎縮變??；肝胰腺切面色淺，變淡黃色，呈糜爛狀；腹節(jié)肌肉透明度下降，變得略微渾濁；對(duì)蝦停止攝食，出現(xiàn)空腸空胃現(xiàn)象（圖1c和圖1d），有癥狀個(gè)體會(huì)逐漸加重，并在隨后幾天內(nèi)死亡。感染第2天即出現(xiàn)有發(fā)病死亡的對(duì)蝦，隨后死亡對(duì)蝦數(shù)量陸續(xù)增加，9 d的累積死亡率為33%；在感染9 d后，幾乎所有存活的對(duì)蝦都出現(xiàn)蝦體顏色變淺、肝胰腺色淺或發(fā)白，肝胰腺切面色淺，糜爛明顯等癥狀（圖1e和圖1f）。感染組2~9 d，每天早上統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)并采集對(duì)蝦肝胰腺、鰓、中后腸道、尾節(jié)肌肉樣品，選取肝胰腺發(fā)白、萎縮且活力明顯下降的瀕死對(duì)蝦，根據(jù)SigmaPlot 12回歸分析，感染所致的LT50為(3.55± 0.12) d（圖2）；對(duì)照組除在第3天和第4天分別意外死亡1尾外，其余時(shí)間未出現(xiàn)死亡。陽(yáng)性組與陰性組差異顯著(<0.05)。

圖1 對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦和浸浴感染VpAHPND后幸存的凡納濱對(duì)蝦外觀

a、b：未感染的對(duì)照組對(duì)蝦(9 d后)；c、d：AHPND感染2 d的患病存活對(duì)蝦； e、f：AHPND感染9 d后的患病存活對(duì)蝦；標(biāo)尺均為1 cm

a, b:without challenge in the control group after day 9; c, d: Morbidsurvival challenged withAHPNDon day 2; e, f: Morbidsurvival challenged withAHPNDafter day 9; Scale bars=1 cm

2.5 組織病理觀察

浸浴感染凡納濱對(duì)蝦過(guò)程中，取樣對(duì)蝦肝胰腺經(jīng)石蠟切片和HE染色制片，進(jìn)行光鏡下病理觀察。結(jié)果顯示，對(duì)照組對(duì)蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞層飽滿，可清晰分辨出B、R、F等各種功能細(xì)胞，R細(xì)胞內(nèi)脂肪泡豐富，細(xì)胞核大小正常，小管間血竇中血細(xì)胞數(shù)量不多（圖3g）。實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦感染后24 h，出現(xiàn)肝胰腺發(fā)白、變淺明顯癥狀的對(duì)蝦肝胰腺脂肪細(xì)胞明顯減少，肝胰腺小管上皮細(xì)胞偶見(jiàn)脫落現(xiàn)象，部分肝胰腺小管上皮層變薄，血竇中血細(xì)胞增多(圖3a)；對(duì)同時(shí)期的瀕死對(duì)蝦取樣的病理切片的肝胰腺則出現(xiàn)更多肝胰腺小管上皮細(xì)胞脫落的現(xiàn)象，此時(shí)，部分細(xì)胞仍然可以看到還有脂肪滴和分泌泡(圖3b)。感染后48 h，出現(xiàn)肝胰腺發(fā)白、萎縮、空腸空胃明顯癥狀的對(duì)蝦肝胰腺出現(xiàn)肝胰腺小管上皮細(xì)胞脫落以及細(xì)胞核腫大現(xiàn)象(圖3c)；同時(shí)期取樣的瀕死對(duì)蝦肝胰腺更是出現(xiàn)了大量血細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，部分小管出現(xiàn)了大量細(xì)菌的二次感染(圖3d)。感染后72 h，出現(xiàn)蝦體發(fā)白、肝胰腺發(fā)白、萎縮、空腸空胃明顯癥狀的對(duì)蝦肝胰腺小管功能細(xì)胞缺失，部分小管上皮細(xì)胞明顯脫落(圖3e)；同時(shí)期取樣的瀕死對(duì)蝦肝胰腺小管細(xì)胞全面壞死，肝胰腺小管間呈現(xiàn)大量血細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)，多數(shù)小管內(nèi)可見(jiàn)嚴(yán)重的二次感染，出現(xiàn)大量的細(xì)菌，部分小管結(jié)構(gòu)完全壞死并被血淋巴細(xì)胞圍繞形成結(jié)節(jié)(圖3f)。

圖2 2.19×105 CFU/ml的VpAHPND 20130629002S01浸浴感染對(duì)蝦累積死亡率

圖3 浸浴感染VpAHPND后不同時(shí)間幸存的有癥狀對(duì)蝦和瀕死對(duì)蝦肝胰腺組織病理變化

a，c，e：分別為感染24、48、72 h時(shí)明顯癥狀的幸存對(duì)蝦肝胰腺組織；b，d，f：分別為感染24、48、72 h瀕死對(duì)蝦肝胰腺組織；g：對(duì)照組對(duì)蝦肝胰腺；箭頭所指處為文中描述的細(xì)胞或組織病變處；標(biāo)尺均為50 μm

a, c, e:Hepatopancreas ofwith typical clinical signs inexperimental group at 24, 48, and 72 h post-challenge respectively; b, d, f: Hepatopancreas of moribundwith typical clinical signs in experimental group at 24, 48, and 72 h post-challenged respectively; g: Hepatopancreas ofnormalin control group;the arrow refers to the cell or tissue lesions described in the paper; Scale bars=50 μm

2.6 感染進(jìn)程中VpAHPND 20130629002S01在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的分布

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在各取樣時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦各組織均能檢測(cè)到pirA，對(duì)照組未檢測(cè)出；各組織中pirA基因的拷貝數(shù)大致分布在101~105copies/mg；組織內(nèi)的菌量隨時(shí)間大體呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖4）。在感染后的2 d內(nèi)，各組織中pirA的拷貝數(shù)都處于較低的水平，肝胰腺、鰓、腸道和肌肉分別為2.67×102、3.49×101、2.09× 101和5.09×101copies/mg；隨后，pirA拷貝數(shù)最早的高峰出現(xiàn)在3 d的鰓中，達(dá)到9.08× 103copies/mg，且高于此時(shí)同一尾蝦的肝胰腺14.3倍、腸道6.63倍和肌肉1.56倍；隨后到達(dá)高峰的是4 d的肝胰腺和肌肉，其中，肝胰腺內(nèi)的pirA拷貝數(shù)達(dá)到8.71×104copies/mg，分別是同一尾蝦肌肉的3.36倍、腸道的6.75倍和鰓的18.7倍；最后達(dá)到高峰的組織是感染后5 d的腸道，為5.76×104copies/mg，此時(shí)，是同一尾蝦的肌肉的5.79倍，肝胰腺的6.44倍，鰓的16.3倍。每毫克組織中pirA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的所有時(shí)段平均值由高到低依次是肝胰腺(3.40±0.80)、腸道(3.30±1.07)、肌肉(3.24±0.88)和鰓(2.71±0.94)。

圖4 2.19×105 CFU/ml VpAHPND 20130629002S01浸浴感染后凡納濱對(duì)蝦不同組織pirA拷貝數(shù)隨時(shí)間變化

3 討論

致AHPND副溶血弧菌感染凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦()、中國(guó)明對(duì)蝦()(Han, 2015a)等水產(chǎn)動(dòng)物后，可導(dǎo)致對(duì)蝦肝胰腺小管細(xì)胞脫落，發(fā)生急性壞死，短期內(nèi)即可導(dǎo)致對(duì)蝦大規(guī)模死亡。AHPND作為近年來(lái)一種危害較大的對(duì)蝦新發(fā)疫病，病原菌的感染機(jī)制以及準(zhǔn)確的診斷方法受到廣泛關(guān)注。AHPND的常規(guī)PCR檢測(cè)方法(Sirikharin, 2014; Otta, 2014)以及實(shí)時(shí)熒光qPCR方法(Han, 2015b)都已經(jīng)建立。前者以檢測(cè)pirA或pirB毒力基因來(lái)定性檢測(cè)AHPND；后者通過(guò)檢測(cè)毒力基因拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)AHPND的定量檢測(cè)，從而可定量地分析病原菌的侵染途徑。本研究采用實(shí)時(shí)熒光qPCR方法，靈敏度可以達(dá)到10 copies/mg組織(Han, 2015b)，且具有很強(qiáng)的特異性，在探討AHPND對(duì)凡納濱對(duì)蝦的感染途徑上是行之有效的方法。

在水環(huán)境中，鰓和消化道是對(duì)蝦與外界接觸的重要器官，病原菌可以通過(guò)鰓或消化道進(jìn)入對(duì)蝦體內(nèi)，增加了對(duì)蝦組織受病原菌感染的可能性。Tran等(2013)采用非創(chuàng)傷的感染方法，是將108CFU/ml的高濃度菌液浸浴對(duì)蝦15 min，然后再維持106CFU/ml的菌量持續(xù)浸浴，這種感染方式除非對(duì)蝦攝食病蝦或高濃度病原菌污染的飼料，否則養(yǎng)殖水體中很難達(dá)到這么高的菌濃度。在本研究測(cè)試浸浴條件下AHPND20130629002S01的LD50，表明該菌株在2.58×105CFU/ml持續(xù)浸浴就能導(dǎo)致半數(shù)死亡，該濃度是普通養(yǎng)殖條件下很容易達(dá)到的濃度，說(shuō)明AHPND20130629002S01菌株能在普通養(yǎng)殖條件下經(jīng)水體導(dǎo)致對(duì)蝦感染，這是養(yǎng)殖條件下AHPND經(jīng)水體感染的直接證明。

由于對(duì)蝦的鰓比表面積大，且與外界水體直接接觸，因此，在浸浴感染中，與肝胰腺、中腸和尾節(jié)肌肉相比，鰓組織中AHPND的量最先達(dá)到較小的峰值，但這種峰值可能是因?yàn)轹w外部富集的病原菌所致，而且，其峰值并沒(méi)有維持下去，隨后肝胰腺及中腸的AHPND量迅速并遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過(guò)了鰓的水平，因此，鰓的小高峰尚不能表明，鰓是病原菌侵入的通道，對(duì)蝦的口器與鰓部靠近，并直通蝦胃及肝胰腺，更可能成為病原菌直接入侵的通道。

對(duì)蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞脫落是AHPND的典型癥狀(Tran, 2013)，肝胰腺是AHPND主要靶器官。本研究實(shí)驗(yàn)組肝胰腺中pirA所代表的AHPND量在感染后的第3天后迅速上升，在第4天時(shí)達(dá)到高峰，且高于所有其他組織出現(xiàn)的最大值，這時(shí)正是半數(shù)死亡時(shí)間，即死亡發(fā)生最多的時(shí)候，表明對(duì)蝦的死亡的確是由AHPND對(duì)肝胰腺的侵染造成的。值得注意的是，病理切片顯示，感染時(shí)間越長(zhǎng)的瀕死個(gè)體，組織病理切片中見(jiàn)到肝胰腺中的細(xì)菌越多，但超過(guò)死亡高峰后，肝胰腺AHPND的量卻大大下降，說(shuō)明此時(shí)主要由細(xì)菌二次感染所致。隨著感染持續(xù)，AHPND從肝胰腺小管中進(jìn)入腸道，第5天時(shí)，AHPND的量在中腸中出現(xiàn)峰值。

由于組織病理分析或分子檢測(cè)都是需要將患病蝦致死進(jìn)行取樣，所以，不同時(shí)間點(diǎn)的樣品來(lái)源不可能是同一尾蝦。本研究采用不同時(shí)間點(diǎn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取3尾的方式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，感染后的組織中pirA拷貝數(shù)相同時(shí)，瀕死對(duì)蝦比呈現(xiàn)AHPND典型癥狀的對(duì)蝦肝胰腺組織病理變化更重，而感染第4天后，瀕死對(duì)蝦即使肝胰腺病變更重，pirA的拷貝數(shù)卻不升反降，這為采樣和檢測(cè)以及對(duì)定性或定量的分子檢測(cè)的解釋提供了參考。養(yǎng)殖場(chǎng)采樣時(shí)，不可能知道每一尾對(duì)蝦確切的感染時(shí)間，有時(shí)對(duì)蝦瀕死狀態(tài)的癥狀典型，但pirA的分子檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性強(qiáng)度不高或者定量值很低，并不能以此為依據(jù)判斷對(duì)蝦的致病不是AHPND所致。最新發(fā)布的OIE(2017)水生動(dòng)物手冊(cè)的AHPND診斷章節(jié)指出，最好的采樣部位是腸道關(guān)聯(lián)的器官，包括肝胰腺、胃、中腸、后腸和糞便。本研究表明，在經(jīng)水傳播AHPND的過(guò)程中，發(fā)病之前，鰓可能有更靈敏的病原菌檢出，而發(fā)病高死亡率期間，肝胰腺是最靈敏的可檢測(cè)組織，而在發(fā)病后期，除了肝胰腺和腸道以外，也可選擇肌肉。

Bell TA, Lightner DV. A handbook of normal penaeid shrimp histology. World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, 1988

Brown WF. Variance estimation in Reed-Muench fifty percent end-point determination. American Journal of Epidemiology, 1964, 79(1): 37–46

Fisheries and Fisheries Administration Bureau of the Ministry of Agriculture. China fishery statistics yearbook. Beijing: China Agricultural Press, 2016 [農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局. 中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2016]

FAO. Report of the FAO/MARD technical workshop on early mortality syndrome (EMS) or acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPNS) of cultured shrimp (under TCP/VIE/3304) Hanoi, Viet Nam, 25–27 June, 2013, FAO Fisheries and Aquaculture Report, 1053

Flegel TW. Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 110(2): 166–173

Han JE, Tang KFJ, Tran LH,.insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of,the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 2015a, 113(1): 33–40

Han JE, Tang KFJ, Pantoja CR,. qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic. Aquaculture, 2015b, 442: 12–15

Joshi J, Srisala J, Truong VH,. Variation in, isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). Aquaculture, 2014, 428–429: 297–302

la Pe?a LD, Cabillon NA, Catedral DD,. Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) outbreaks inandcultured in the Philippines. Diseases of Aquatic Organisms, 2015, 116(3): 251–254

Lee CT, Chen IT, Yang YT,. The opportunistic marine pathogenbecomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(34): 10798–10803

Lightner DV, Redman RM, Pantoja CR,. Early mortality syndrome affects shrimp in Asia. Global Aquaculture Advocate, 2012, (Jan/Feb): 40. https://www.aquaculturealliance.org/ pdf/GAA-Lightner-Jan12.pdf

Nunan L, Lightner DV, Pantoja C,. Detection of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Mexico. Diseases Aquatic Organisms, 2014, 111(1): 81–86

OIE. Manual of diagnostic tests for aquatic animals. World Organisation of Animal Health. 2017, http://www.oie.int/ international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/

Otta SK, Praveena P, Bhuvaneswari T,. Protocols for detection of shrimp EMS/AHPND. Training Manual on Health Management Practices for Finfish and Shellfish of Brackish Water Environment 115. Aquaculture Animal Health and Environment Division, Central Institute of Brackishwater Aquaculture, Puran, Chennai, 2014, 98–100

Sirikharin R, Taengchaiyaphum S, Sritunyalucksana K,. A new and improved PCR method for detection of AHPND bacteria. https://enaca.org/?id=96&title=new-pcr-detection- method-for-ahpnd, 2014

Sotorodriguez SA, Gomezgil B, Lozanoolvera R,. Field and experimental evidence ofas the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease of cultured shrimp () in Northwestern Mexico. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 81(5): 1689–1699

Tang KFJ, Pantoja CR, Redman RM,. Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of(EHP), a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp. Journal of Invertebrate Pathology, 2015, 130: 37–41

Tran L, Nunan L, Redman RM,. Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 2013, 105(1): 45–55

Yang YT, Chen IT, Lee CT,. Draft genome sequences of four strains of, three of which cause early mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp in China and Thailand. Genome Announcements, 2013, 2(5): 814–830

Zhang BC, Liu F, Bian HH,. Isolation, identification, and pathogenicity analysis of astrain from. Progress in Fishery Sciences, 2012, 33(2): 56–62 [張寶存, 劉飛, 邊慧慧, 等. 一株凡納濱對(duì)蝦病原菌的分離、鑒定及其致病力分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(2): 56–62]

Zhang QL, Liu Q, Liu S,. A new nodavirus is associated with covert mortality disease of shrimp. Journal of General Virology, 2014, 95(12): 2700–2709

(編輯 陳嚴(yán))

Quantitative Analysis of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease Causing(AHPND) in Infected

CHEN Mengmeng1,2, DONG Xuan1, QIU Liang1,2, WAN Xiaoyuan1, XIE Guosi1, HUANG Jie1,2①

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) results from acute toxicity in the hepatopancreas of infected shrimp caused by the toxic proteins PirAVpand PirBVp, which are expressed by the pVA1 plasmid carried by AHPND-causing(AHPND). In this study,were exposed to 2.19×105CFU/mlAHPNDstrain 20130629002S01 by immersion to explore the dynamic changes ofAHPNDin the tissues of shrimp. The hepatopancreas, gills, midgut, and muscle of infected shrimp were collected 2~9 days after immersion infection, and the quantity ofpirAwas measured by qPCR. The results showed thatAHPNDcould be detected in all sampled tissues of infected shrimp. The amount ofAHPNDin the hepatopancreas reached a peak on day 4 post-infection at 8.71×104copies/mg, while the gills, muscle, and midgut reached peaks on day 3, 4, and 5 post-infection at 9.08×103、2.59×104、5.76×104copies/mg, respectively. The highest amount ofAHPNDwas detected in the gills during the early stage of infection, followed by the hepatopancreas and midgut in sequence during heavy disease, with frequent deaths. Subsequently, the amount ofAHPNDdeclined rapidly in all tissues, with similar levels in the midgut, hepatopancreas, and muscle. Histopathology revealed that AHPND lesions were denser in hepatopancreas samples from moribund shrimp compared with those from morbid shrimp, when taken at the same time from infection. Furthermore, the histopathologic symptoms of both became more severe along the infection process, but with decreasing levels ofAHPND. The results showed that the copy number ofpirAin tissues ofAHPND-infected shrimp does not represent the real-time condition of diseased shrimp and the quantity ofAHPNDmay not be high in a severe AHPND sample.

Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND);; Immersing infection;; qPCR; Time courses

HUANG Jie, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20170414001

S941.4

A

2095-9869(2018)04-0093-08

* 中國(guó)東盟海上合作基金項(xiàng)目(2016-2018)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室主任基金(QNLM201706)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2017HY-ZD10)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(20603022016012)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)共同資助[This work was supported by China ASEAN Maritime Cooperation Fund Project (2016-2018), Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (QNLM201706), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2017HY-ZD10), Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022016012), and China Agriculture Research System (CARS-47)].陳蒙蒙, E-mail: mmchen0104@163.com

黃 倢，研究員，E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

2017-04-14,

2017-06-11

陳蒙蒙, 董宣, 邱亮, 萬(wàn)曉媛, 謝國(guó)駟, 黃倢. 凡納濱對(duì)蝦感染致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(AHPND)的定量分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(4): 93–100

Chen MM, Dong X, Qiu L, Wan XY, Xie GS, Huang J. Quantitative analysis of acute hepatopancreatic necrosis disease causing(AHPND) in infected. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 93–100