張廣明 孫秀俊 吳 彪 楊愛國 劉志鴻 周麗青 劉寒苗 趙 慶

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蝦夷扇貝EST-SSR標(biāo)記在櫛孔扇貝中的通用性研究*

張廣明1,2,3孫秀俊1,2吳 彪1,2楊愛國1,2①劉志鴻1,2周麗青1,2劉寒苗1,2,3趙 慶1,2,3

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071； 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

為研究蝦夷扇貝()和櫛孔扇貝()的群體遺傳多樣性并分析其親緣關(guān)系，對在蝦夷扇貝中開發(fā)的60個EST-SSR位點在櫛孔扇貝中的通用性進行了研究。結(jié)果顯示，21個位點可在櫛孔扇貝中擴增出特異性條帶，通用性比例達35.00%，其中，17個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性比例達28.33%。在蝦夷扇貝和櫛孔扇貝群體中，平均等位基因數(shù)(N)分別為2.7647和2.3529；平均有效等位基因數(shù)(N)分別為1.9487和1.6350；平均觀測雜合度(H)為0.6314和0.3333；平均期望雜合度(H)為0.4569和0.3139；平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.3726和0.2597；Nei's (1973)基因多樣性指數(shù)()分別為0.4493和0.3087；Shannon信息指數(shù)分別為0.7176和0.5041；固定指數(shù)(F)檢測發(fā)現(xiàn)，7個位點偏離了Hardy-Weinberg平衡；遺傳分化系數(shù)(F)為0.2398。本研究開發(fā)的21對通用性EST-SSR標(biāo)記，為進一步開展蝦夷扇貝和櫛孔扇貝遺傳多樣性分析、分子輔助育種、基因發(fā)掘和種質(zhì)資源評價奠定了基礎(chǔ)。

蝦夷扇貝；櫛孔扇貝；EST-SSRs；微衛(wèi)星；多態(tài)性；通用性

櫛孔扇貝()主要分布于我國北方近海、日本、韓國和俄羅斯等沿海。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，出現(xiàn)了養(yǎng)殖產(chǎn)量下降和病害頻發(fā)等問題(王如才等, 2004)。而蝦夷扇貝()屬冷水性雙殼貝類，原產(chǎn)于日本北海道及本洲北部、俄羅斯千島群島的南部海域及朝鮮附近(常亞青等, 2008; 楊愛國等, 2004)。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體出現(xiàn)了苗種成活率低、成體小型化、高死亡率和病害頻發(fā)等問題(張明明等, 2008; 楊培民等, 2007; 李云峰等, 2011)。蝦夷扇貝和櫛孔扇貝在育苗和養(yǎng)殖上均遇到了瓶頸和無法單獨解決的難題，而應(yīng)用遺傳學(xué)手段進行良種培育，選育抗病、抗逆和生長快的新品種(品系)是實現(xiàn)扇貝養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑(Li, 2005)。

EST-SSR側(cè)翼序列在物種之間高度保守，因此，EST-SSR引物可在物種之間通用。種間通用性分子標(biāo)記作為重要的遺傳學(xué)研究工具，對種間進化關(guān)系研究、種間比較作圖、通用性遺傳圖譜構(gòu)建等具有重要的意義(王曉澗, 2012)。蝦夷扇貝和櫛孔扇貝標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用的工作已有大量研究，現(xiàn)已有ISSR技術(shù) (呂振明, 2006; 何斌等, 2007)、RAPD技術(shù)(滕麗莉等, 2005)、SRAP技術(shù)(程寧寧等, 2009)和AFLP技術(shù) (于濤等, 2011)研究了蝦夷扇貝、櫛孔扇貝的遺傳特性，但由于操作復(fù)雜或準(zhǔn)確率低等缺點限制了分子標(biāo)記的進一步發(fā)展，而基因組EST(表達序列標(biāo)簽，Expressed Sequence Tags，ESTs)兼具基因組微衛(wèi)星標(biāo)記的孟德爾遺傳共顯性的遺傳特征和直接標(biāo)記功能基因的優(yōu)點，同時，相比其他分子標(biāo)記，可靠性更高，且擴增的目標(biāo)序列在基因的編碼區(qū)開發(fā)成本較低，遺傳信息含量豐富等優(yōu)點(劉芳，2006)。因此，本研究對60對蝦夷扇貝EST引物在櫛孔扇貝基因組中的通用性進行了分析，對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的群體遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進行了分析，以期為進一步的分子輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

蝦夷扇貝(殼長為 10~12 cm)和櫛孔扇貝(殼長為7~8 cm)均于2015年6月取自山東煙臺長島養(yǎng)殖區(qū)，從2個群體中分別隨機選取30個個體作為研究材料，活體運回實驗室，–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物的設(shè)計與合成

從已發(fā)表的文獻(Zhang, 2016; Sun, 2016)中選擇多態(tài)性高且擴增效果好的60對蝦夷扇貝微衛(wèi)星引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 模板DNA的制備

模板DNA提取自扇貝的閉殼肌。取其閉殼肌組織100 mg剪碎，加入500 μl勻漿緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；100 mmol/L EDTA，pH 8.0)，混勻后加入終濃度為0.5%的SDS和50 μg/ml的蛋白酶K，55℃消化 3 h，然后分別用等體積的酚∶氯仿(1:1)，氯仿∶異戊醇(24:1)抽提，2倍體積乙醇沉淀，ddH2O溶解?；蚪MDNA濃度由GENEQUANTpro (Eppendorf) RNA/DNA分析定量儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。模板DNA用滅菌的超純水稀釋成50 ng/μl，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增與電泳檢驗

PCR反應(yīng)體系總體積為10 μl，包括10×Buffer 1 μl、Mg2+(25 mmol/L)0.6 μl、dNTPs (各2 mmol/L) 1 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1μl、模板DNA 1μl、DNA聚合酶(Promega) 0.5 U，加超純水補足10 μl。反應(yīng)在Eppendorf擴增儀上進行。PCR反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性2 min，然后95℃ 45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在 1%的瓊脂糖凝膠上電泳進行預(yù)檢測，然后在8%的變性聚丙烯酰氨凝膠上進行電泳分離，電泳結(jié)果銀染顯色。待凝膠干燥后使用掃描儀記錄電泳圖譜。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)每個個體產(chǎn)生的條帶位置確定其基因型，利用Cervus 3.0軟件計算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,H)、期望雜合度(Expected heterozygosity, H)、等位基因數(shù)(Number of allele,N)、有效等位基因數(shù)(Effective number of allele,N)、Nei群體間的相似性系數(shù)和群體間遺傳距離以及統(tǒng)計量進行遺傳多樣性的分析，統(tǒng)計顯著性水平用Bonferroni校正。

有效等位基因數(shù)：

式中，p為第個等位基因的頻率。

多態(tài)信息含量的計算方法：

式中，為等位基因數(shù)目，p和p分別為第和第個等位基因的頻率。

平均雜合度觀測值：H= 觀察到的雜合個體總數(shù)/觀察到的個體總數(shù)；

固定指數(shù)(F)：F=1 – (o/e)

-統(tǒng)計量(F)：F= σ2/(1 –)

式中，為某等位基因在整個群體中的平均頻率; σ2為該等位基因在分群體之間的方差。

Nei群體間的相似性系數(shù)：

式中，X、Y分別為和群體第個位點的等位基因頻率。

Nei群體間遺傳距離：

D= –ln

加上偏差矯正后為：

式中，X、Y分別為和群體第個位點的等

位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1 扇貝屬間通用性引物的篩選

將60對蝦夷扇貝微衛(wèi)星引物在蝦夷扇貝和櫛孔扇貝基因組DNA中進行PCR擴增。根據(jù)電泳條帶優(yōu)化反應(yīng)條件，調(diào)整退火溫度及時間，最終有21對引物可穩(wěn)定擴增，條帶之間較為清晰，引物通用性比例達35.00%，其中，17對引物的擴增產(chǎn)物具有多態(tài)性，占總數(shù)的28.33%(表1)。

表1 在蝦夷扇貝和櫛孔扇貝基因組中擴增出多態(tài)性條帶的17對EST-SSRs

Tab.1 Seventeen polymorphic EST-SSRs were amplified from the genomes of the scallops P. yessoensis and C. farreri.

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

17對EST引物在蝦夷扇貝、櫛孔扇貝群體中均能檢測到較高的多態(tài)性，但多態(tài)性水平有所不同(表2)。蝦夷扇貝、櫛孔扇貝群體等位基因數(shù)變化范圍都為2.00~4.00，平均等位基因數(shù)(N)分別為2.7647和2.3529；平均有效等位基因數(shù)(N)分別為1.9487和1.6350；觀測雜合度(H)范圍為0.0667~0.9667和0~0.9667，平均為0.6314和0.3333；期望雜合度(H)范圍為0.1588~ 0.6576和0.0333~0.6672，平均為0.4569和0.3139；多態(tài)信息含量(PIC)范圍為 0.1500~0.5724 和 0.0323~ 0.5814，平均為0.3726和0.2597。

表2 17個EST-SSR位點在蝦夷扇貝、櫛孔扇貝各30個個體中的遺傳特征

Tab.2 Characterization of 17 EST-SSRs in 30 scallops P. yessoensis and C. farreri

F1：蝦夷扇貝群體；F2：櫛孔扇貝群體。統(tǒng)計顯著性水平用Bonferroni校正(Rice, 1989;=17)，*：<0.05；**：<0.01

F1:; F2:. Table-wide significance levels were applied, using the sequential Bonferroni technique (Rice, 1989;=17), *:<0.05; **:<0.01

2.3 扇貝群體遺傳變異性分析

蝦夷扇貝和櫛孔扇貝群體遺傳結(jié)構(gòu)變化和21對EST引物在2個群體內(nèi)偏離Hardy-Weinberg平衡程度見表2。從表2可以看出，從F參數(shù)看，2個群體中7對引物偏離Hardy-Weinberg平衡，其中，位點comp88965_c0在2個群體中均偏離了Hardy-Weinberg平衡。從-檢驗的數(shù)據(jù)來看(表 3)，配對比較F值(F<0.05)。通過17對微衛(wèi)星位點計算總的遺傳分化系數(shù)(F)為0.2398，表明有23.98%的遺傳變異來自于群體之間，76.02%來自個體之間。此外，對F值的計算表明，除了comp100440_c1、contig_963940和contig_988858的F>0，其他14個位點F<0，呈現(xiàn)雜合子過剩狀態(tài)。2個扇貝群體在comp91359_c0、comp100440_c1、comp91909_c0、contig_1217920、contig_1443641、contig_293601、contig_963940、contig_ 915269、contig_763705、contig_988858 10個引物呈現(xiàn)一定程度的雜合子缺失。

表3 扇貝2個群體17個微衛(wèi)星位點的-檢驗分析

Tab.3 F-statistics for two scallop populations at seventeen microsatellite loci

3 討論

3.1 蝦夷扇貝EST-SSR位點的通用性研究

EST-SSR標(biāo)記來源于基因的編碼區(qū)，具有開發(fā)成本低、信息含量豐富、擴增效率高等優(yōu)點(Wang, 2009; 李云峰等, 2011)。本研究從蝦夷扇貝的EST文庫中分離和篩選了60對多態(tài)性位點，多態(tài)性比例達40.0%，這與太平洋牡蠣()EST-SSR的多態(tài)性比例相似(王艷紅等, 2007)。而劉博等(2011)研究表明，縊蟶()EST-SSR的多態(tài)性比例達35.0%，與本研究結(jié)果基本一致。由于微衛(wèi)星側(cè)翼序列在種間或?qū)匍g有高度保守性，因此，開發(fā)通用性位點應(yīng)用于近源物種成為可能。有學(xué)者研究表明，文蛤()微衛(wèi)星引物在彩虹明櫻蛤()和青蛤()的引物通用性分別為10.3%和6.9%(李曉英等, 2010)，美洲紫海膽()EST-SSR在光棘球海膽()中的引物通用性為22.50% (李晶晶，2008)。而本研究中，蝦夷扇貝EST-SSR在櫛孔扇貝中的引物通用性比例達35.00%，這與楊璞等(2008)和李曉英等(2010)的研究結(jié)果相一致，但低于櫛孔扇貝 cSNP 引物在蝦夷扇貝中52.27%的通用性比例(李晶晶, 2008)，原因可能是SNP標(biāo)記相比SSR重復(fù)序列具有更高的遺傳穩(wěn)定性，且更容易對數(shù)據(jù)進行自動化和規(guī)模化分析，王曉澗等(2012)的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。

3.2 蝦夷扇貝EST-SSR位點的開發(fā)及群體遺傳多樣性分析

本研究中2個扇貝群體中的F大部分為負(fù)值，表明這些基因座存在遠(yuǎn)交或雜交現(xiàn)象，2個種群均處于雜合度過剩狀態(tài)，這可能是純合致死或是群體內(nèi)自然選擇引起的(張海濱, 2005; 王宇等, 2012)。Hardy- Weinberg平衡和多態(tài)性信息含量是經(jīng)常用來衡量群體遺傳結(jié)構(gòu)變異程度高低的重要參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，有7個位點偏離了平衡，可能是人為因素的干擾，導(dǎo)致種群內(nèi)基因缺失造成雜合子缺失。其中，6個位點為高度多態(tài)性基因座(PIC>0.5)，占總位點數(shù)的35.29%；11個位點為中度多態(tài)性基因座(0.25H和H分別為0.6314和0.4569，高于在櫛孔扇貝群體中的H(0.3333)和o(0.3139)，由此可知，蝦夷扇貝群體的遺傳多樣性略高于櫛孔扇貝群體。同時，這組數(shù)據(jù)高于利用AFLP研究不同地理群體蝦夷扇貝遺傳多樣性的平均雜合度，可能是SSR比AFLP技術(shù)更加靈敏導(dǎo)致，劉芳(2006)、薛明等(2006)的研究也說明這一點。

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Zhang MM, Zhao W. Causes of death ofin China and control measures. China Fisheries, 2008(2): 65–66 [張明明, 趙文. 我國蝦夷扇貝死亡原因的探討及控制對策. 中國水產(chǎn), 2008(2): 65–66]

(編輯 陳嚴(yán))

Transferability of EST-SSR frominto

ZHANG Guangming1,2,3, SUN Xiujun1,2, WU Biao1,2, YANG Aiguo1,2①, LIU Zhihong1,2, ZHOU Liqing1,2, LIU Hanmiao1,2,3, ZHAO Qing1,2,3

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

In this study, expressed sequence tag (EST)-SSR markers were developed to investigate the genetic relationship between two commercially important scallop species, Yesso scallopand Zhikong scallopA total of 60 EST-SSRs previously developed fromwere selected, and their cross-species amplification inwas analyzed. As a result, 21 pairs of EST-SSR primers showed unique PCR products. The interspecies transferability was calculated to be 35.00%. Among the 21 EST-SSR primers, 17 were polymorphic in the studied populations, which resulted in 28.33% transferability. In the two populations ofand, the number of alleles ranged from 2.00 to 4.00, with mean allele numbers of 2.7647 and 2.3529, respectively. The mean effective number of alleles was estimated to be 1.9487 and 1.6350, while the mean observed heterozygosity was 0.6314 and 0.3333, respectively. Similar to the observed heterozygosity, the mean expected heterozygosity was higher in(0.4569) than in(0.3139). For the two populations, the diversity index was consistently higher inthan inThe mean polymorphism information content was estimated to be 0.3726 and 0.2597, and Nei’s (1973) genediversity index was calculated to be 0.4493 and 0.3087, respectively. Furthermore, Shannon’s information index in the two populations was 0.7176 and 0.5041, respectively. The genetic identity between the two species was calculated to be 0.619, with a high genetic divergence between them (0.480). Among the polymorphic markers, seven loci significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium according to the average fixation index (F). The genetic differentiation index (F) between the two populations was estimated to be 0.2398. The EST-SSR markers developed for cross-species amplification ofandare important resources for the study of genetic diversity, marker-assisted breeding, gene discovery, and genetic evaluation of germplasm resources.

;; EST-SSRs; Microsatellites; Polymorphism; Transferability

YANG Aiguo, E-mail: yangag@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20170503002

S968.31

A

2095-9869(2018)04-0139-08

* 國家自然科學(xué)基金(31602153)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室開放基金 (2016LMFS-B02)、海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室開放基金(KLM2018004)和山東省自然科學(xué)基金(ZR2016CQ32)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31602153), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, P. R. China (2016LMFS-B02), the Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China (KLM2018004), and Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2016CQ32)]. 張廣明，E-mail: zgm985623@163.com

楊愛國，研究員，E-mail: yangag@ysfri.ac.cn

2017-05-03,

2017-05-16

張廣明, 孫秀俊, 吳彪, 楊愛國, 劉志鴻, 周麗青, 劉寒苗, 趙慶. 蝦夷扇貝EST-SSR標(biāo)記在櫛孔扇貝中的通用性研究. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2018, 39(4): 139–146

Zhang GM, Sun XJ, Wu B, Yang AG, Liu ZH, Zhou LQ, Liu HM, Zhao Q. Transferability of EST-SSR frominto. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 139–146