薛榆潔 胡歆瀅 張 慧 何逸昉 童鶴艷 許 可

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325000；2.溫州大學(xué)生命科學(xué)研究院，浙江 溫州 325000）

熊果苷又名熊果素，化學(xué)名是4-羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是一種源于杜鵑花科熊果屬植物-熊果的葉子中分離的一種苷類化合物。隨著國(guó)外越來(lái)越多的專利到期，過(guò)去只能在高檔護(hù)膚品中才能用的熊果苷也越來(lái)越普及。熊果苷有2個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)式：α-熊果苷和β-熊果苷，葡糖殘基和酚基是熊果苷的兩個(gè)重要功能基團(tuán)，其中酚基對(duì)酪氨酸酶（人體合成黑色素關(guān)鍵酶）具有很強(qiáng)的抑制作用，此外熊果苷屬于氫醌葡萄糖苷類化合物，作為護(hù)膚品美白添加劑，其在一定條件下，分子中的葡萄糖分子與氫醌之間形成的類糖苷鍵具有斷裂的可能性。然而國(guó)內(nèi)對(duì)熊果苷性質(zhì)的基礎(chǔ)理論研究較少，導(dǎo)致護(hù)膚品行業(yè)中添加熊果苷缺少相關(guān)理論依據(jù)，并且近年來(lái)人們對(duì)護(hù)膚品中熊果苷的毒性以及副作用也提出了質(zhì)疑，因此加強(qiáng)對(duì)熊果苷理化性質(zhì)研究具有重要的意義。本課題通過(guò)研究不同產(chǎn)地及構(gòu)型熊果苷美白及安全性，滲透劑組合對(duì)熊果苷經(jīng)皮滲透的影響以及護(hù)膚品基礎(chǔ)條件如pH值、氧氣等對(duì)熊果苷穩(wěn)定性的影響，篩選出熊果苷用于護(hù)膚品的最優(yōu)組合或配方。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（MD，美國(guó)），正置熒光顯微鏡（尼康，日本），YB-P6 智能透皮試驗(yàn)儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），細(xì)胞超凈臺(tái)（蘇潔凈化設(shè)備公司）。

1.2 試劑

α-熊果苷（荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)），α-熊果苷及β-熊果苷（西安奧賽生物），B16黑色素細(xì)胞（上海中喬新舟），酪氨酸及酪氨酸酶（上海阿拉丁生物有限公司），CCK-8（碧云天生物有限公司），PBS磷酸緩沖液（自配），甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水溶性氮酮（西安奧賽生物），甘油（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

小鼠，雄性，體重（20±2）g，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。

1.4 酶標(biāo)儀檢測(cè)酪氨酸酶活性

體外酪氨酸酶活性檢測(cè)：按順序依次加入磷酸鹽緩沖液1mL、樣品溶液（熊果苷或熊果苷+影響因素）0.5mL、酪氨酸溶液2.5mL，于37℃水浴10min。然后加入酪氨酸酶液1mL，混勻，再37℃孵育30min，迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中，在475nm處測(cè)定吸光度。

細(xì)胞酪氨酸酶活性檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄上清液，每孔加入含1%TritonX-100的PBS緩沖液90μL，加入10μL 1mg/mL的左旋多巴（L-DOPA），37℃孵育60min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)475nm下各孔的OD值。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶活性=（試驗(yàn)孔OD475nm-空白孔OD475nm）/（對(duì)照孔OD475nm-空白孔OD475nm）。

1.5 熊果苷經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

將小鼠斷頸處死后，用電動(dòng)剃須刀剌干凈腹部的毛，用手術(shù)剪小必剪取腹部的皮膚，剔除表皮下的脂肪和粘連物，用生理鹽水反復(fù)清洗干凈，置在生理鹽水中，保存在冰箱里備用（在一周之內(nèi)使用），實(shí)驗(yàn)前自然解凍小鼠皮，并用生理鹽水反復(fù)清洗干凈。采用改良的Franz擴(kuò)散池法，利用智能透皮試驗(yàn)儀，將離體鼠皮平固定于擴(kuò)散池和接收池么間，并使角質(zhì)層面向供給擴(kuò)散池。擴(kuò)散池加入熊果苷或熊果苷+基礎(chǔ)原料等，接收池中加入PBS緩沖液，加入過(guò)程中保證氣泡排出，并加入磁力攪拌子，恒溫水浴在37℃，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始于3h取樣1mL，0.22μm微孔過(guò)濾后，HPLC檢測(cè)。

1.6 熊果苷穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將熊果苷組或熊果+不同基礎(chǔ)環(huán)境組（不同pH值組，含氧及不含氧組）置于50℃恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中，放置1個(gè)月以上（高溫加速試驗(yàn)）。然后取出樣品，觀察顏色變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用Origin8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外水平研究不同來(lái)源及構(gòu)型熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性抑制情況

本研究分別選取荷蘭帝斯曼的α-熊果苷（1kg/1萬(wàn)），國(guó)產(chǎn)α-熊果苷和β-熊果苷來(lái)研究不同原料產(chǎn)地以及構(gòu)型對(duì)黑色素生成的關(guān)鍵酶-酪氨酸酶活性的影響。體外研究發(fā)現(xiàn)，熊果苷能有效抑制酪氨酸酶的活性，其中進(jìn)口α-熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性抑制率高于國(guó)產(chǎn)α-熊果苷和β-熊果苷。接下來(lái)，我們考察了部分護(hù)膚品基質(zhì)原料對(duì)熊果苷酪氨酸酶抑制活性的影響，從圖1（b）我們可以發(fā)現(xiàn)，甘油、聚乙烯醇及水溶性氮酮對(duì)α-熊果苷酪氨酸酶抑制活性影響不大，而煙酰胺和山梨酸鉀促進(jìn)了熊果苷酪氨酸酶抑制效率。這些研究表明，進(jìn)口α-熊果苷具有更好的酪氨酸酶抑制活性，同時(shí)一般護(hù)膚品基質(zhì)如滲透劑、防腐劑、保濕劑等對(duì)熊果苷酪氨酸抑制活性影響較小。

2.2 細(xì)胞水平研究不同產(chǎn)地、構(gòu)型熊果苷對(duì)黑色素細(xì)胞B 1 6活性及酪氨酸酶活性抑制情況

從體外水平我們發(fā)現(xiàn)進(jìn)口α-熊果苷酪氨酸酶抑制效果更好，為驗(yàn)證不同產(chǎn)地熊果苷的潛在毒性，本研究選擇不同濃度α-熊果苷去處理B16細(xì)胞，CCK-8結(jié)果顯示隨著熊果苷濃度升高，熊果苷毒性逐漸增強(qiáng)，表明熊果苷在一定濃度范圍毒性可控，此外相同濃度下進(jìn)口α-熊果苷毒性明顯低于國(guó)產(chǎn)α-熊果苷（如圖2（a）所示）。光鏡圖也顯示相同濃度下進(jìn)口α-熊果苷比國(guó)產(chǎn)于α-熊果苷毒性更小，B16細(xì)胞數(shù)目更多，細(xì)胞飽滿度更好（如圖2（b）所示）。

接下來(lái)我們?cè)诩?xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證國(guó)產(chǎn)α-熊果苷及β-熊果苷對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶抑制活性。在考慮細(xì)胞毒性情況下，研究α/β-熊果苷對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制情況，同樣發(fā)現(xiàn)熊果苷能抑制B16細(xì)胞酪氨酸酶活性，與體外結(jié)果不同的是，α-熊果苷抑制效率更優(yōu)于β-熊果苷（如圖3所示）。結(jié)合上述體內(nèi)和細(xì)胞研究，我們可以得出，α-熊果苷具有更好的酪氨酸酶抑制活性，同時(shí)進(jìn)口α-熊果苷安全性能更好。因此接下來(lái)我們選取進(jìn)口α-熊果苷進(jìn)行深入的研究。

2.3 熊果苷經(jīng)皮滲透的研究

幾乎所有分子透過(guò)表皮的量都是微量級(jí)的，所以護(hù)膚品中常常添加一些透皮促進(jìn)劑如氮酮等，此外發(fā)現(xiàn)一些多元醇類也能促進(jìn)藥物吸收，本研究初步考察了水溶性氮酮和甘油單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)熊果苷經(jīng)皮滲透的影響。α-熊果苷高效液相條件摸索：色譜柱Syncronis? C18柱，4.6mm×150mm，ID=5μm；流動(dòng)相∶水∶甲醇 =80∶ 20（v/v）；流速：0.5mL?min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；進(jìn)樣量為10μL。熊果苷HPLC高效液相如圖4所示。

我們接下來(lái)選取了護(hù)膚品常用化學(xué)促滲透劑-氮酮以及保濕劑-甘油，來(lái)研究二者對(duì)熊果苷經(jīng)皮滲透的影響（如圖5（a）所示）。研究發(fā)現(xiàn)，隨著甘油添加量逐漸升高，熊果苷滲透率也逐漸增高，而氮酮+甘油則能顯著促進(jìn)熊果苷經(jīng)皮滲透效果（如圖5（b）所示），說(shuō)明二元促滲劑具有協(xié)同促熊果苷的經(jīng)皮滲透。此外，不少護(hù)膚品公司選取更加溫和的試劑來(lái)替代氮酮，例如戊二醇和己二醇等，這值得我們繼續(xù)深入地研究復(fù)合多元醇的滲透性能。

圖1 不同產(chǎn)地、構(gòu)型熊果苷及基礎(chǔ)原料加熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的影響

圖2 熊果苷對(duì)B16黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.4 護(hù)膚品基質(zhì)環(huán)境對(duì)熊果苷穩(wěn)定的影響

熊果苷由于分子間的葡萄糖分子與氫醌之間形成的類糖苷鍵容易受到氧氣、光照、pH值等影響而發(fā)生斷裂，而發(fā)生變色。筆者了解到不少護(hù)膚品公司相關(guān)熊果苷產(chǎn)品在保存半年左右就出現(xiàn)了變色問(wèn)題，這極大地影響了產(chǎn)品的銷售。因此本項(xiàng)目初步考察了不同pH值（5，6和7，pH4對(duì)皮膚傷害太大故舍棄）以及氧氣對(duì)熊果苷穩(wěn)定的影響，研究發(fā)現(xiàn)在高溫加速條件下（相當(dāng)于常溫12個(gè)月），pH7熊果苷溶液（1%）變色顏色最深，而pH5顏色最淺（如圖6（a）所示）；通過(guò)添加亞硫酸氫鈉來(lái)去除氧氣的影響，發(fā)現(xiàn)添加亞硫酸氫鈉后，熊果苷溶液（1%，pH6）顏色透明澄清，而未添加亞硫酸氫鈉熊果苷溶液（1%，pH6）組顏色變黃（如圖6（b）所示）。這些實(shí)驗(yàn)證明熊果苷的類糖苷鍵在弱酸環(huán)境下比較穩(wěn)定，同時(shí)在體系中添加亞硫酸氫鈉去除氧氣同樣能有效保持熊果苷的澄清透明。接下來(lái)我們將繼續(xù)研究護(hù)膚品添加劑對(duì)熊果苷穩(wěn)定性的影響。

圖3 熊果苷對(duì)B16黑色素細(xì)胞黑色素酶抑制的影響

圖4 熊果苷高效液相色譜圖

圖5 熊果苷高效液相色譜圖

圖6 護(hù)膚品基礎(chǔ)環(huán)境對(duì)熊果苷穩(wěn)定性的影響

結(jié)論

熊果苷目前作為高端護(hù)膚品中美白添加劑，目前在面膜、精華液中應(yīng)用越來(lái)越廣，國(guó)外對(duì)熊果苷的相關(guān)研究較早，而我國(guó)對(duì)熊果苷用于護(hù)膚品的研究則相對(duì)有限，很多護(hù)膚品公司在添加熊果苷時(shí)候，對(duì)α和β-熊果苷基礎(chǔ)環(huán)境未做深入研究。本研究初步比較了不同品牌和構(gòu)型的熊果苷美白抑制效果和細(xì)胞毒性，同時(shí)研究了目前護(hù)膚品中常用促滲透劑對(duì)熊果苷經(jīng)皮滲透的影響，最后研究了護(hù)膚品基礎(chǔ)條件對(duì)熊果苷穩(wěn)定的影響。然而本研究還有許多地方研究的不深入，例如目前多元促滲透劑能否進(jìn)一步促進(jìn)熊果苷經(jīng)皮吸收，熊果苷在最優(yōu)保存條件下是或還會(huì)產(chǎn)生微量的對(duì)苯二酚，這都需要我們進(jìn)一步關(guān)注。