張恩平,田悅悅,李 猛,時 毛,蔣雨含,任如冰,張淑紅

沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院,沈陽 110866

1904年德國學者Hiltner用“根際”這一概念來表示高等植物根周圍是微生物活動的特殊地帶[1]?，F(xiàn)在我們用根際表示會受植物根系影響、靠近植物根系1—2 mm的微域土區(qū),它也是土壤微生物非?；钴S的一個區(qū)域[2]。有學者認為,根際微生物群落的宏基因組是植物體的第二基因組[3]。土壤微生物是土壤中活的有機體,是最活躍的土壤肥力因子之一,它們的變化能反映出土壤生物活性水平,并對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的影響[4]。微生物系統(tǒng)多樣性與根際息息相關。根際附近的微生物多樣性較高,它隨著與根際垂直距離的增加而減小[5]。與大多數(shù)非根際土相比,根際土壤的微生物種群更多。

施肥是影響土壤質(zhì)量和可持續(xù)發(fā)展的重要措施之一[6],土壤微生物功能多樣性能夠反映土壤中微生物的生態(tài)特征,不同物種下的土壤[7]、不同管理策略下的農(nóng)業(yè)土壤[8]和不同植被的根際土壤[9]等研究多數(shù)涉及土壤微生物。長期采用不同的施肥方式,土壤有機質(zhì)含量和組成會有較大變化,土壤微生物多樣性也呈現(xiàn)較大的差異[10]。不同施肥處理中的土壤微生物量、微生物活性及群落功能也不相同。長期施肥使土壤微生物量碳氮[11]、土壤呼吸[12]和微生物功能活性[13]增強。而時鵬等人[14]發(fā)現(xiàn),連作的玉米在單施氮肥條件下土壤微生物活性和功能多樣性下降。孫鳳霞等[15]對長期不同施肥的紅壤研究結果表明,施用有機肥能顯著提高紅壤的微生物生物碳氮和微生物碳源利用能力,提高紅壤肥力,保持作物高產(chǎn)。

長期施肥能夠使土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和功能結構發(fā)生顯著變化[16],研究不同施肥措施對農(nóng)田養(yǎng)分循環(huán)以及施肥與環(huán)境之間的關系具有重要價值[17]。本研究以沈陽農(nóng)業(yè)大學長期定位施肥基地的番茄根際土壤為研究對象,分析其微生物的功能多樣性,旨在探究根際土壤微生物對施肥的響應,為番茄根際生態(tài)過程中的科學調(diào)控提供理論依據(jù),這對于我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤樣品取自沈陽農(nóng)業(yè)大學試驗基地——番茄長期定位施肥小區(qū),試驗小區(qū)地處遼寧省沈陽市沈河區(qū)(41°31′N,123°24′E),屬于北溫帶半濕潤大陸性氣候。于1988年開始長期露地定位施肥試驗,1997年移入設施內(nèi)繼續(xù)進行。供試土壤類型為草甸土,土壤(0—20 cm)原始農(nóng)化性狀：有機質(zhì)24.3 g/kg；堿解氮86.41 mg/kg；速效磷70.80 mg/kg；速效鉀56.14 mg/kg；pH值6.75。腐熟的馬糞有機質(zhì)含量為33.6 g/kg；全氮(N)9.20 g/kg；全磷(P2O5)6.27 g/kg；全鉀(K2O)4.23 g/kg。該實驗2016年至今栽培的蔬菜為番茄,品種為金冠9號。本研究在蔬菜長期定位施肥試驗的基礎上按原有計劃正常進行,選取11個處理進行試驗,以不施肥的CK為對照,其他處理分別為：N、K、P、NP、NPK、MN、MK、MP、MNP、MNPK。M代表施加有機肥,N、P、K分別表示氮、磷、鉀。采用完全隨機區(qū)組設計,3次重復。小區(qū)面積為1.5 m2,每個小區(qū)建成0.8 m深的無底水泥地,有效防止肥料間的相互滲透影響。馬糞(有機肥)、P肥和K肥作為基肥,于定植前一次性施入,N肥在生長季節(jié)內(nèi)分兩次施入。具體施肥量如表1。

表1 有機肥(M)和N、P、K肥處理及施肥量

N：氮肥,nitrogen fertilizers；K：鉀肥,potassium fertilizers；P：磷肥,phosphate fertilizers；NP：氮磷肥,nitrogen + phosphate fertilizers；NPK：氮磷鉀肥,nitrogen + phosphate + potassium fertilizers；MN：有機肥配施氮肥,organic manure + nitrogen fertilizers；MK：有機肥配施鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；MP：有機肥配施磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNP：有機肥配施氮磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNPK：有機肥配施氮磷鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；CK：不施肥,no fertilization control

1.2 根際土壤樣品采集

2016年7月25日番茄拉秧期將番茄植株從土壤中取出,盡量減少對根系的損傷,用軟毛刷清掃根系上的土壤,即根際土。所得土樣分成兩份,一部分用于根際微生物群落功能多樣性的測定,此部分土壤樣品保存于-4℃；另一部分風干后,用于基本土壤理化性質(zhì)的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)的測定

取風干土壤,過2 mm篩,用于土壤理化性質(zhì)的測定。直接用pH計測定土壤pH值,水土比2.5∶1；重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測定土壤有機質(zhì)含量；堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；鉬銻抗比色法(0.5 mol/L NaHCO3浸提)測定速效磷含量；火焰光度計法(NH4OAc浸提)測定速效鉀含量。

1.3.2 土壤微生物功能多樣性分析

采用Biolog-ECO微平板法進行微生物功能多樣性分析。稱取5 g新鮮土樣置于高壓滅菌的錐形瓶中,加入45 mL已滅菌的0.85%的生理鹽水,封口,振蕩30 min后,將土壤菌懸原液進行2次10倍稀釋。將稀釋液接種到平板中,接種量為150 μL。接種好的ECO平板加蓋,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)168 h,每隔24 h用BIOLOG自動讀數(shù)裝置在590 nm下對其吸光值進行測定。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

AWCD(average well color development)：Biolog-ECO微平板的每孔平均吸光值,表示土壤微生物群落碳源利用的整體能力：

式中,Ci為所測定的31個碳源孔吸光值；R為對照孔吸光值；n為碳源數(shù)目(n=31)。

群落多樣性可以由土壤微生物群落利用碳源類型的差異來體現(xiàn)。

優(yōu)勢度指數(shù)D

香農(nóng)指數(shù)H：反映土壤微生物群落物種變化度和差異度,指數(shù)值越大,表示微生物物種豐富度越高。

H=-∑Pi(lnPi)

式中,Pi為第i孔相對吸光值與整板平均相對吸光值總和的比,即:

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

豐富度指數(shù)S=碳源代謝孔的總數(shù)目(微孔的光密度值≥0.25,則認為該孔碳源被利用,即為碳源代謝孔) 。

均勻度指數(shù)E：是基于物種數(shù)量反映群落種類多樣性,群落中生物種類增多代表群落的復雜程度增高。

采用Excel、SPSS 18.0等軟件對數(shù)據(jù)進行初級分析、單因素方差分析、顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 長期不同施肥對根際土壤理化性質(zhì)的影響

經(jīng)過29年的連續(xù)施肥,不同施肥處理的番茄根際土壤pH均有顯著差異,對照CK的pH值最大,為7.37。對pH影響的顯著性可以歸納為N > P > K。由表2可以看出,土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀等養(yǎng)分含量在施用有機肥條件下顯著增高,且高于原始量。有機質(zhì)測定結果表明,單施N、P、K肥對根際土壤有機質(zhì)的含量無顯著影響,但均高于不施肥的CK處理。經(jīng)過長期的定位施肥,除N處理外,所有處理的堿解氮、速效磷和速效鉀含量均高于不施肥的對照CK,各處理間差異顯著。測定結果見表2。

表2 長期不同施肥處理對根際土壤理化性質(zhì)的影響

同一列中具有相同字母表示結果差異不顯著(P<0.05)

2.2 長期不同施肥處理下番茄根際土壤的總AWCD值分析

平均顏色變化率(AWCD)是表征土壤微生物群落對底物碳源利用強度的指標,AWCD值越大,表明對碳源利用強度越強,微生物代謝活性越高。培養(yǎng)開始后,每隔24 h測定AWCD值,得到AWCD隨時間變化的動態(tài)圖。從圖1可以看出,不同施肥處理土壤的AWCD值隨培養(yǎng)時間的延長而提高,即不同處理微生物的碳源利用程度逐漸增強。各處理在0—24 h內(nèi)土壤的AWCD值變化不明顯,均小于0.1,表明碳源基本未被微生物群落利用；24—96 h內(nèi)則表現(xiàn)出快速增長的趨勢,微生物活性旺盛。培養(yǎng)120 h后,AWCD值隨培養(yǎng)時間的延長增長趨于緩慢。這表明AWCD在120 h時處于“拐點”處,采用120 h的吸光值進行分析能真實地反映實際情況。

圖1 長期不同施肥各處理平均每孔顏色變化率Fig.1 AWCD of the soil microbial community in long-term different fertilization treatmentsN：氮肥,nitrogen fertilizers；K：鉀肥,potassium fertilizers；P：磷肥,phosphate fertilizers；NP：氮磷肥,nitrogen + phosphate fertilizers；NPK：氮磷鉀肥,nitrogen + phosphate + potassium fertilizers；MN：有機肥配施氮肥,organic manure + nitrogen fertilizers；MK：有機肥配施鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；MP：有機肥配施磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNP：有機肥配施氮磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNPK：有機肥配施氮磷鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；CK：不施肥,no fertilization control

在整個培養(yǎng)過程中,不同處理微生物群落的AWCD存在明顯差異。以120 h處的AWCD為例,表現(xiàn)為MNP > MK > MN > MNPK > MP > N > NPK > K > NP > P > CK,值在0.266—1.155之間。MNP處理最高,活性最強；CK處理最低,活性最弱。整體來看,配施有機肥處理高于單施無機肥處理。

2.3 長期不同施肥處理土壤微生物碳源利用特征

通過不同處理下根際土壤微生物對6類碳源類型利用程度的分析可知,在6類碳源中,氨基酸類碳源利用能力最高,酚酸類碳源利用能力最低。依次為：氨基酸類>聚合物類>糖類>羧酸類>胺類>酚酸類。所有施肥處理的數(shù)據(jù)均大于不施肥的對照,說明長期施肥改變了土壤微生物對碳源的利用能力。配施有機肥處理的土壤微生物對6類碳源的總利用高于單施化肥處理,以MNP優(yōu)勢最明顯。MNPK、NP、K處理土壤微生物對聚合物類碳源的利用能力最高；MNP處理土壤微生物對酚酸類和聚合物類碳源的利用能力較高；MP處理的土壤微生物對氨基酸類碳源的利用能力較高；MK、NPK處理土壤微生物對氨基酸類和聚合物類碳源的利用能力最高；MN處理土壤微生物對氨基酸類和胺類碳源的利用能力最高；P處理的土壤微生物對羧酸類碳源的利用能力較高；N處理的土壤微生物對氨基酸類和糖類碳源的利用能力較高(圖2)。

圖2 不同處理土壤微生物對六類碳源的總體利用狀況(120 h)Fig.2 The overall utilization of six kinds of carbon sources in different treatmentsN：氮肥,nitrogen fertilizers；K：鉀肥,potassium fertilizers；P：磷肥,phosphate fertilizers；NP：氮磷肥,nitrogen + phosphate fertilizers；NPK：氮磷鉀肥,nitrogen + phosphate + potassium fertilizers；MN：有機肥配施氮肥,organic manure + nitrogen fertilizers；MK：有機肥配施鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；MP：有機肥配施磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNP：有機肥配施氮磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNPK：有機肥配施氮磷鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；CK：不施肥,no fertilization control

2.4 土壤微生物碳代謝的主成分分析

利用培養(yǎng)120 h的AWCD值,對長期施肥土壤微生物利用單一碳源的特性進行主成分分析。在31個因子中共提取6個主成分,累計方差貢獻率達到76.013%。其中第一主成分(PC1)的特征根為12.76,方差貢獻率為41.16%,第二主成分(PC2)的特征根為3.40,方差貢獻率為10.97%。其余3—6主成分的方差貢獻率均小于10%。選取PC1和PC2分析不同施肥處理下番茄根際土壤微生物碳源利用情況,不同施肥處理的碳源利用能力在PC軸上差異顯著。CK、N、K位于PC1負端,PC2負端,這些處理根際土壤的微生物對碳源的利用方式比較接近；P、MNPK位于PC1負端,PC2正端,MK位于PC2正端；表明其受PC2上的主要碳源影響較大；MN位于PC1正端,PC2負端,表明其受PC1上的主要碳源影響較大； MNP位于PC1正端,PC2正端,同時受PC1和PC2上主要碳源的影響(圖3)。

圖3 不同處理土壤微生物碳代謝主成分分析Fig.3 The principal component analysis (PCA)of soil microbial biomass carbon metabolism in different treatmentsN：氮肥,nitrogen fertilizers；K：鉀肥,potassium fertilizers；P：磷肥,phosphate fertilizers；NP：氮磷肥,nitrogen + phosphate fertilizers；NPK：氮磷鉀肥,nitrogen + phosphate + potassium fertilizers；MN：有機肥配施氮肥,organic manure + nitrogen fertilizers；MK：有機肥配施鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；MP：有機肥配施磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNP：有機肥配施氮磷肥,organic manure + potassium fertilizers；MNPK：有機肥配施氮磷鉀肥,organic manure + potassium fertilizers；CK：不施肥,no fertilization control

進一步分析31種碳源在PC1、PC2上的載荷值,載荷值越高表示對應碳源對主成分的影響越顯著。由表可知,以∣r∣>0.4計,對PC1貢獻大的碳源有12種,主要包括糖類4種,氨基酸3種,羧酸類2種,酚酸類1種及胺類2種；對PC2貢獻較大的有8種,主要包括糖類1種,羧酸類4種,聚合物2種及酚酸類1種。

表3 不同碳源種類在PC1和PC2上的載荷值

綜合上述分析,在PC1上,MN、MNP處理土壤微生物對D,L-a-甘油、D-半乳糖內(nèi)酯、葡萄糖- 1-磷酸鹽、N-乙?；?D-葡萄胺、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、L-天冬酰胺酸、D-葡萄胺酸、 2-羥苯甲酸、苯乙基胺、腐胺和D-半乳糖醛酸的利用能力較強。在PC2上,P、NPK、NP、MK、MNP處理土壤微生物對D-木糖、a-丁酮酸、衣康酸、D-半乳糖醛酸、D-蘋果酸、肝糖、a-環(huán)式糊精和 4-羥基苯甲酸的利用能力較強(表3)。

2.5 長期不同施肥處理的番茄根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

利用培養(yǎng)120 h的31種碳源的AWCD值,對不同施肥處理的番茄根際土壤微生物功能多樣性的香農(nóng)指數(shù)(H),豐富度指數(shù)(S)、均勻度指數(shù)(E)及優(yōu)勢度指數(shù)(D)進行計算分析,結果如表4所示。從表中我們可以看出,施加肥料的處理的香農(nóng)指數(shù)、豐富度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)均高于不施肥的處理,但是使其均勻度下降。

表4 不同施肥處理下土壤微生物多樣性指數(shù)

同一列中具有相同字母表示結果差異不顯著(P<0.05)

說明施肥顯著提高番茄根際土壤微生物的種類數(shù)以及增加土壤微生物的碳源利用能力,然而隨著肥料的施用,會破壞土壤固有環(huán)境,影響其均勻度。配施有機肥處理的豐富度指數(shù)普遍高于單施化肥處理,其他指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù))在是否配施有機肥上沒有顯著差異。K、NP、NPK、MN和MNP處理的均勻度顯著低于其他處理,說明其個體分布最不均勻,群落所含信息量最小。MNP處理的香農(nóng)指數(shù)、豐富度指數(shù)均顯著高于其他處理。

3 結論與討論

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中,微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主要參與者,是土壤養(yǎng)分的儲備庫和周轉(zhuǎn)庫[18]。很多因素都可以影響土壤中的微生物的群落多樣性,如土壤質(zhì)地、植被類型、施肥制度和茬口安排等。李娟[19]和孫瑞蓮等[20]在研究中發(fā)現(xiàn),長期有機無機肥配施能明顯提高土壤有機質(zhì)和N、P、K養(yǎng)分含量,同時促進微生物的代謝和繁殖,提高土壤微生物碳源利用能力及微生物群落功能多樣性。

從本研究結果看,不同施肥處理下的番茄根際土壤堿解氮、速效磷、速效鉀含量均存在顯著差異,總體趨勢是：配施有機肥>單施化肥>不施肥。葛曉光等[21]研究表明,長期的有機無機肥配施可以有效提高土壤養(yǎng)分含量。配施有機肥可以顯著提高土壤有機質(zhì)含量。因此在實際生產(chǎn)中,可通過增施有機肥或有機肥與無機肥配施來改善土壤理化性質(zhì)。土壤調(diào)查和長期定位試驗表明,我國大部分農(nóng)田因過量投入氮肥導致土壤酸化程度加重[22],在本研究中也表現(xiàn)出相同的結果,施加N肥的處理的酸化程度尤為嚴重。

在根際土壤微生物方面,配施有機肥可以增加土壤微生物的數(shù)量[23],增強微生物的活性[24- 25],提高微生物群落的多樣性[26- 28]。平均顏色變化率(AWCD)能夠反映土壤微生物對碳源的利用能力和代謝活性大小,本研究結果表明配施有機肥土壤微生物的AWCD值高于單施化肥處理,推測是有機肥的投入,提高了土壤有機質(zhì)含量,改善了土壤理化性質(zhì),優(yōu)化了土壤微生物生存條件,從而提高了土壤微生物群落代謝功能。Boehm[29]和Tiquia等[30]研究也指出,土壤有機質(zhì)含量和組成是影響微生物生物量、群落組成、生物活性的關鍵因素,這與本研究結果達成一致。本研究中所有施肥處理的AWCD值均高于不施肥的對照CK,以MNP最高,MK和MN、MNPK處理在120 h時差異不大,但均高于NPK、N、K處理,說明N、K肥對AWCD值的影響是相似的。有研究表明,土壤元素缺乏或者施肥不均衡都會對微生物群落的多樣性產(chǎn)生負效應[31]。土壤微生物碳源利用多樣性可能與碳源種類,植物殘體和根系分泌物、土壤物理性狀和化學性質(zhì)等密切相關[32]。

本研究對六類碳源的總體利用情況顯示,番茄根際土壤微生物對氨基酸類碳源的利用能力最高,不同處理間以MNP的利用碳源能力最高。劉恩科和羅希茜等人[33,16]研究表明,化肥或秸稈施入會促進微生物生長, 使微生物的碳源利用率明顯升高,使土壤中微生物碳氮量明顯高于單施化肥的處理,而秸稈還田與當?shù)亓晳T施肥卻對土壤微生物碳源利用能力有不利的影響。另外,本研究出現(xiàn)了MNP處理的代謝活性高于MNPK的情況,這與長期施肥條件下MNP處理的番茄植株根系分泌質(zhì)子、酚酸類物質(zhì)息息相關。曹享云等人[34-36]研究表明,在特定養(yǎng)分脅迫條件下,植物根系可通過自身的調(diào)節(jié)能力,合成一些專一性物質(zhì)分泌到根際中去,特別是簡單有機化合物,如有機酸、糖類等,這些有機化合物中的有機酸能夠活化土壤中的礦物態(tài)鉀,促進土壤鉀的有效化,并提高植物對缺鉀脅迫環(huán)境的適應能力。

從微生物多樣性指數(shù)來看,根際土壤微生物群落的優(yōu)勢度指數(shù),豐富度指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均體現(xiàn)出對施肥的顯著正相關,這可能是由于施加肥料中的C/N有利于土壤微生物的生長,為微生物提供了較多的能源和養(yǎng)分,促進土壤微生物大量繁殖,加快微生物的新陳代謝,

這與徐陽春[37]和顧美英[38]等人研究結果一致。然而,均勻度指數(shù)卻隨著有機肥和化肥的施入呈現(xiàn)下降的趨勢,這可能是因為隨著有機肥及無機化肥的施入,促進了某些微生物種群的生長代謝而抑制了其他種微生物種群的代謝,致使均勻度下降。

主成分分析解釋不同處理下番茄根際土壤微生物碳源利用是否存在差異[39]。有機肥顯著提高對糖類、酚酸類、胺類碳源的利用。P、K肥能夠提高對羧酸類和聚合物類碳源的利用。也進一步證明了隨不同肥料的長期施入,不同處理的根際土壤微生物群落發(fā)生了改變。對PC1貢獻較大的碳源主要是糖類,對PC2貢獻較大的碳源主要是羧酸類,這可能與根系的分泌為土壤微生物提供了大量糖類等碳源物質(zhì)有關,其促進了與碳源利用類型相對應的微生物的生長與繁殖,這也可能會引起微生物群落結構的改變,具體還有待繼續(xù)研究。

綜上所述,番茄作為重要的設施蔬菜,一直處在長期定位施肥條件下,其生長環(huán)境可能會出現(xiàn)不同處理間不同程度的養(yǎng)分虧缺及土壤微生態(tài)環(huán)境的惡化,導致微生物的結構和功能發(fā)生改變。本研究探討了長期定位施肥條件下,番茄根際微生物的功能多樣性變化,結果表明肥料的施用有利于提高土壤微生物代謝活性和土壤微生物群落功能多樣性,尤其是在配施有機肥的情況下。其中以MNP的施肥較果最佳,能夠呈現(xiàn)較高的根際土壤微生物功能多樣性。番茄植株本身可能會分泌大量的糖類、氨基酸類、有機酸類等物質(zhì)來影響根際微環(huán)境,使其適應長期施用單一種類肥料造成的養(yǎng)分虧缺狀況。這種微生物種群的變化是植物通過自身調(diào)節(jié)來適應土壤環(huán)境的結果,進而影響根際微生態(tài)。這種植物-土壤-微生物相互作用的深入研究將會為番茄根際生態(tài)過程的科學調(diào)控提供理論參考。