管淑紅，王智剛，朱煜明，徐乾乾，周 軍

(江蘇省常州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 213000)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)本質(zhì)為原因不清楚的間質(zhì)性肺炎，主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)的纖維化，以往研究認(rèn)為該病尚無特效藥物治療和改善預(yù)后[1]。隨著對(duì)該病的重視，越來越多的新藥涌現(xiàn)出來，2015版IPF治療指南依據(jù)一些新藥研究證據(jù)，對(duì)吡非尼酮和尼達(dá)尼布這兩種藥物進(jìn)行了有條件推薦[2]。鑒于我國(guó)的國(guó)情，IPF患者通常面臨經(jīng)濟(jì)成本、依從性等挑戰(zhàn)，從這兩種藥物中獲益甚少。

柴胡皂甙具有抗病毒、抗炎、抗肝腎等器官纖維化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、治療腎炎等作用，其中最具有活性的成分是柴胡皂甙D(SSD) 。本課題組致力于研究SSD對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制，早期部分動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)SSD能通過保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞免于過度凋亡、抑制成纖維細(xì)胞增殖等機(jī)制緩解肺纖維化病情[3]，本文將系列報(bào)道SSD對(duì)肺纖維化小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的干預(yù)作用及機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 所有實(shí)驗(yàn)小鼠均購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為清潔級(jí)6周，體質(zhì)量為18～22 g，雄性昆明種，總共60只。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠分為3組：對(duì)照組、博來霉素(BLM)組及SSD組，各20只。BLM組和SSD組通過文獻(xiàn)[4]方法制備肺纖維化模型，均給予氣管內(nèi)注入濃度為5 mg/kg的 BLM溶液，并通過旋轉(zhuǎn)的方式保證藥物充分分布在肺內(nèi)，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。而對(duì)照組則給予相同體積0.9%的氯化鈉。配置SSD溶液方法如下：將SSD 20 mg溶入二甲基亞砜(DMSO)3 mL中，用生理鹽水稀釋至100 mL，避光保存，SSD組每日腹腔內(nèi)注入SSD溶液(2.0 mg/kg)，BLM組和對(duì)照組每日同等條件下腹腔內(nèi)注入0.2 mL生理鹽水+DMSO(3 mL DMSO 溶于97 mL生理鹽水)，連續(xù)28 d。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 在用藥后的第14、28天，各組隨機(jī)選取10只實(shí)驗(yàn)小鼠，均取出其肺組織，右肺組織保存于-70 ℃冰箱，用于檢測(cè)E鈣黏蛋白、抗纖維連接蛋白、Wnt蛋白和β-actenin蛋白的表達(dá)；左肺完整置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色。

1.2.2病理切片觀察 將多聚甲醛固定后的左肺組織用石蠟包埋，切片后給予蘇木素-伊紅(HE)染色，然后通過光鏡下觀察肺組織的損傷程度和膠原纖維的變化，采用SZAPIEL等[5]研究分級(jí)。肺泡炎：0級(jí)為無肺泡炎癥；Ⅰ級(jí)為輕度肺泡炎，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅱ級(jí)為中度肺泡炎；Ⅲ級(jí)為重度肺泡炎，病變彌漫。肺纖維化：0級(jí)為無或少量膠原纖維；Ⅰ級(jí)為膠原纖維輕度增多；Ⅱ級(jí)為膠原纖維中度增多，可伴有肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；Ⅲ級(jí)為膠原纖維明顯增多，肺泡塌陷、融合、結(jié)構(gòu)紊亂。肺泡炎及肺纖維化等級(jí)資料分別記為1～4分。

1.2.3Western blot檢測(cè)肺組織E鈣黏蛋白、纖維連接蛋白、Wnt蛋白、β-actenin蛋白表達(dá) 100 mg組織加1 mL RIPA裂解液于玻璃勻漿器中研磨、裂解。離心后加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸后于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中恒壓90 V電泳2 h，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗2 h，二抗1 h，用顯色劑ECL-plus染色最后在Typhoon掃描儀中成像，采用Imagequant TL軟件分析光密度值。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)觀察 光鏡下觀察，對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。BLM組第14天炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增寬(圖1B)；第28天肺組織結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡塌陷融合，其間可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見大量寬帶狀及片狀膠原纖維，呈彌漫性肺纖維化(圖1C)。SSD組肺泡炎及肺纖維化程度較同期BLM組均明顯減輕(圖1D和 1E)。各組小鼠肺泡炎和肺纖維化程度的定量分析結(jié)果見表1。對(duì)照組第14和28 天肺泡炎和肺纖維化程度評(píng)分比較無明顯差異，其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，SSD組和BLM組肺泡炎及肺纖維化程度評(píng)分均高于同期對(duì)照組(P<0.05)，且SSD組低于同期BLM組(P<0.05)。

2.2Western blot檢測(cè)肺組織E鈣黏蛋白、纖維連接蛋白表達(dá) 在造模第14和28天，Western blot檢測(cè)肺組織E鈣黏蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而纖維連接蛋白表達(dá)則顯著上調(diào)(P<0.05)。同期相比，SSD組和BLM組E鈣黏蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，且SSD組高于BLM組(P<0.05)；同期相比，SSD組和BLM組纖維連接蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)，且SSD組低于BLM組(P<0.05),見圖2～4。

表1 各組小鼠給藥后肺泡炎和肺纖維化程度評(píng)分比較分)

a：P<0.05，b：P<0.01,與對(duì)照組比較；c：P<0.05，d：P<0.01,與BLM組比較

A：對(duì)照組第28天；B：BLM組第14天；C：BLM組第28天；D：SSD組第14天；E：SSD組第28天

圖1各組小鼠給藥后不同時(shí)間肺組織病理形態(tài)變化(HE，×200)

圖2 E鈣黏蛋白和纖維連接蛋白的Western blot

*：P<0.05，與第14天比較；◇：P<0.05，與同期對(duì)照組比較；▽：P<0.05，與同期SSD組比較

圖3 E鈣黏蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值比較

*：P<0.05，與第28天比較；◇：P<0.05，與同期對(duì)照組比較；▽：P<0.05，與同期BLM組比較

圖4纖維連接蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值比較

圖5 Wnt蛋白和β-actenin蛋白的Western blot電泳圖

*：P<0.05，與第28天比較；◇：P<0.05，與同期對(duì)照組比較；▽：P<0.05，與同期BLM組比較

圖6 Wnt蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值比較

*：P<0.05，與第28天比較；◇：P<0.05，與同期對(duì)照組比較；▽：P<0.05，與同期BLM組比較

圖7 β-actenin蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值比較

2.3Western blot檢測(cè)肺組織Wnt蛋白、β-actenin蛋白表達(dá) 在造模第14和28天，Western blot檢測(cè)肺組織Wnt蛋白、β-actenin蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。同期相比，SSD組和BLM組Wnt蛋白、β-actenin蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)，且SSD組低于BLM組(P<0.05)，見圖5～7。

3 討 論

IPF的發(fā)病受多種因素影響，主要包括炎癥導(dǎo)致的組織損失和組織損傷后的修復(fù)疊加等。CHINLOSI等[6]通過免疫組織化學(xué)染色研究了20例IPF患者的肺活檢標(biāo)本，其中在18例患者的增殖性細(xì)支氣管損害局灶發(fā)現(xiàn)了胞核內(nèi)Wnt途徑靶基因產(chǎn)物cyclinD1、β-catenin和基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)，表明IPF的發(fā)病與Wnt途徑的活化有關(guān)；同時(shí)，該研究在其他類型的間質(zhì)性肺病(inter stitial lung disease，ILD)患者的標(biāo)本中均沒有檢測(cè)到胞核內(nèi)Wnt途徑相關(guān)分子表達(dá)的改變，表明Wnt途徑的活化僅限于IPF。此外，研究還顯示W(wǎng)nt途徑的活化在EMT中具有重要的作用，導(dǎo)入Wnt-1基因可以增高M(jìn)DCK和HCE等上皮細(xì)胞系細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的表達(dá)，促使淋巴樣增強(qiáng)因子1(LEF1)轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)輕微的EMT；DLD-1上皮腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入LEF-1基因后，其胞核內(nèi)β-catenin呈現(xiàn)穩(wěn)定的高表達(dá)，導(dǎo)致顯著EMT的發(fā)生，因此EMT過程具有可逆性[7]。但是，Wnt途徑的活化在EMT過程中的作用及其在IPF發(fā)病中對(duì)肺內(nèi)細(xì)胞和分子的影響需要進(jìn)行更進(jìn)一步的研究[8]。

本文對(duì)上皮標(biāo)志E-鈣黏蛋白及間葉標(biāo)志纖維連接蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，予以SSD干預(yù)后，無論是復(fù)制肺纖維化模型的中期還是后期，E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)均受到保護(hù)，而纖維連接蛋白的表達(dá)上調(diào)卻被抑制，這與德國(guó)COSTABEL等[9]提出的IPF的EMT學(xué)說結(jié)果一致，WOLTERS等[10-11]的研究也證實(shí)了這一結(jié)果。有研究[12-14]顯示，BLM組小鼠肺組織表達(dá)Wnt蛋白及β-catenin蛋白有明顯上調(diào)，這可能與IPF患者的肺組織內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路異常激活，β-catenin是Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心因子有關(guān)[15]。SSD組中小鼠肺組織表達(dá)Wnt蛋白及β-catenin蛋白顯著低于BLM組，這可能是由于SSD通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路介入EMT病理過程從而減緩肺組織纖維化進(jìn)展。

依據(jù)IPF發(fā)病機(jī)制觀點(diǎn)的改變，治療IPF理念也發(fā)生相應(yīng)變化，目前推薦及早的給予抗纖維化，加上小劑量抗炎，在于預(yù)防而不是逆轉(zhuǎn)已存在的肺纖維化。2012年，Panther-IPF臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)波尼松、硫唑嘌呤、N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合治療IPF未有療效，反而增加病死率和住院風(fēng)險(xiǎn)[16]。因此，在IPF治療中，干預(yù)Wnt/β-catenin通路中的一個(gè)或幾個(gè)環(huán)節(jié)，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)鏈、抑制EMT進(jìn)程，可以達(dá)到預(yù)防和控制病情的療效。